足底電擊應(yīng)激時(shí)程對(duì)大鼠焦慮樣行為的影響

【摘要】 目的 觀察足底電擊應(yīng)激時(shí)程對(duì)大鼠高架十字迷宮及開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)焦慮樣行為的影響。方法 選取成年雄性 SD 大鼠按照體重分層隨機(jī)分為對(duì)照組和足底電擊組，每組 12 只。足底電擊組予以不可逃避性足底電擊( 0. 8 m A，電擊 10 s，休息 20 s，共 5 min，1 次/d) 結(jié)合孤養(yǎng)建立大鼠焦慮模型。分別在足底電擊 7 d 及 14 d 后測(cè)高架十字迷宮和開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，評(píng)估大鼠的焦慮行為。結(jié)果 7 d 及 14 d 足底電擊后，足底電擊組焦慮樣行為增加，差異具有顯著意義( P ＜ 0. 01) ，入臂總次數(shù)明顯低于對(duì)照組，運(yùn)動(dòng)活性降低。開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)足底電擊組進(jìn)入中心區(qū)次數(shù)及中心區(qū)逗留時(shí)間低于對(duì)照組( P ＜ 0. 01) ，運(yùn)動(dòng)總距離、直立次數(shù)及理毛次數(shù)足底電擊組均明顯低于對(duì)照組( P ＜0. 01) ，運(yùn)動(dòng)探索活性降低。比較 7 天及 14 天足底電擊組行為學(xué)結(jié)果，可見(jiàn)隨著造模天數(shù)的增加，大鼠閉臂時(shí)間比及閉臂次數(shù)比呈現(xiàn)下降趨勢(shì)( P ＜ 0. 05) ，焦慮程度降低。開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)總距離、直立次數(shù)及理毛次數(shù) 14 d 低于 7d，差異具有顯著性( P ＜ 0. 05) ，提示大鼠運(yùn)動(dòng)探索行為進(jìn)一步減少，自我關(guān)注度降低，抑郁樣行為增加。結(jié)論 不同時(shí)程的足底電擊應(yīng)激導(dǎo)致大鼠焦慮樣行為，影響大鼠運(yùn)動(dòng)探索活性。隨著造模天數(shù)的增加，大鼠行為可能從焦慮樣向抑郁樣改變。足底電擊應(yīng)激焦慮模型造模時(shí)程的選擇 7 d 優(yōu)于 14 d。

【關(guān)鍵詞】 焦慮; 動(dòng)物模型; 足底電擊; 行為學(xué)

焦慮障礙在現(xiàn)今社會(huì)非常普遍，病程緩慢，與眾多負(fù)面結(jié)果相關(guān)，如自殺風(fēng)險(xiǎn)更大，合并內(nèi)科病，并且當(dāng)與抑郁共病緩解率低。焦慮障礙的研究需要?jiǎng)游锬Ｐ偷闹С帧ｋm然嚙齒類(lèi)動(dòng)物焦慮樣行為與人類(lèi)臨床焦慮定義有所區(qū)別，二者相似的受累腦區(qū)，以及人類(lèi)抗焦慮藥物對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物行為學(xué)的改善，說(shuō)明嚙齒類(lèi)動(dòng)物焦慮樣行為的研究可以對(duì)人類(lèi)的焦慮問(wèn)題研究提供線索。

應(yīng)激在神經(jīng)變性疾病和精神疾病相關(guān)的眾多病理生理過(guò)程中扮演重要角色。過(guò)度的應(yīng)激反應(yīng)與焦慮相關(guān)。已有研究顯示短期的慢性應(yīng)激可導(dǎo)致大鼠焦慮樣行為。足底電擊應(yīng)激是經(jīng)典應(yīng)激方式的一種，廣泛地應(yīng)用于條件恐懼相關(guān)研究。

焦慮與恐懼關(guān)系密切，已有不少研究采用不可避免足底電擊應(yīng)激制造焦慮抑郁動(dòng)物模型。但目前缺少不同時(shí)程的足底電擊應(yīng)激對(duì)大鼠焦慮樣行為影響的研究。我們將成年 SD 大鼠足底電擊不同時(shí)程后，觀察不同程度的慢性應(yīng)激刺激對(duì)大鼠高架十字迷宮及開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)所示焦慮樣行為的影響，目的是尋找到足底電擊焦慮模型的最佳造模時(shí)間節(jié)點(diǎn)，為研究典型焦慮樣行為提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1. 1 材料

1. 1. 1 動(dòng)物及分組

SPF 級(jí) SD 雄性大鼠 24 只，體重為 200 ～ 220 g，6周齡，由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心( 西普爾-必凱) 提供【SCXK( 滬) 2013 －0016】。動(dòng)物飼養(yǎng)在大鼠通風(fēng)鼠籠中，環(huán)境溫度控制在 21 ～ 23℃，濕度為 50% 左右，食水自由。實(shí)驗(yàn)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn) 動(dòng) 物 中 心【SYXK( 蘇) 2014 －0001】?jī)?nèi)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置嚴(yán)格遵守我國(guó)科技部 2006 年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。動(dòng)物適應(yīng)飼養(yǎng)一周后，按體重分層隨機(jī)分為對(duì)照組( control group，12 只) 、足底電擊組( footshock group，F(xiàn)S，12 只) 。

1. 1. 2 儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)器材: 足底電擊箱( SLY-SRC 刺激記錄控制器，北京碩林苑科技有限公司) ; 大鼠通風(fēng)鼠籠( EVC，蘇州猴皇動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)備科技有限公司) ; 動(dòng)物行為錄像及分析采用SuperMaze動(dòng)物行為視頻分析系統(tǒng)( XR-Xmaze，上海欣軟信息科技有限公司) 。

1. 2 方法

1. 2. 1 實(shí)驗(yàn)方案

為避免大鼠間氣息交流影響情緒狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)足底電擊組均采用孤養(yǎng)，大鼠通風(fēng)鼠籠設(shè)備可避免大鼠間氣息交流。對(duì)照組群養(yǎng)，每日撫摸數(shù)分鐘，余不作任何處理。足底電擊組每日接受一次足底電擊，電擊參數(shù): 0. 8 m A，電擊 10 s，休息 20 s，共 5min。在足底電擊 7 d 及 14 d 后測(cè)高架十字實(shí)驗(yàn)( 10: 00 ～ 12: 30) 、開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)( 14: 00 ～ 15: 00) ，評(píng)估大鼠的焦慮行為。

1. 2. 2 高架迷宮實(shí)驗(yàn)

高架十字迷宮(XR-XG201) 裝置(SuperMaze動(dòng)物行為視頻分析系統(tǒng)XR-Xmaze，上海欣軟信息科技有限公司) 由兩條相對(duì)開(kāi)放臂( 50 cm × l0 cm) 和兩條相對(duì)閉合臂( 50 cm × l0 cm ×40 cm) 及中央?yún)^(qū)( 10 cm× l0 cm) 連接而成，距離地面 50 cm。實(shí)驗(yàn)前將大鼠搬至實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境 1 h 以上，保持室內(nèi)安靜，暗光。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)將大鼠從中央格面向閉合臂放入迷宮，記錄 5 min 內(nèi)的活動(dòng)情況。觀察大鼠進(jìn)入開(kāi)臂和閉臂的次數(shù)及停留時(shí)間。每只大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取出，將各臂清理干凈，并用 75% 的酒精去除氣味。行為學(xué)結(jié)果(1) 閉臂時(shí)間比 = 閉臂時(shí)間/( 開(kāi)臂時(shí)間 + 閉臂時(shí)間) ; (2) 閉臂次數(shù)比 = 閉臂次數(shù)/( 開(kāi)臂次數(shù) + 閉臂次數(shù)) 。(3) 入臂總次數(shù) = 閉臂次數(shù) + 開(kāi)臂次數(shù)。行為學(xué)結(jié)果應(yīng)用 SPSS 軟件箱式圖法剔除離群值。

1. 2. 3 開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)敞箱（由上海欣軟信息科技有限公司提供）長(zhǎng) × 寬 × 高為: 100 cm × 100 cm ×40 cm，內(nèi)面及底面均為灰色，中央?yún)^(qū)正上方安置攝像頭。實(shí)驗(yàn)第 8 天及第 15 天時(shí)，每組大鼠分別進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前把動(dòng)物提前 1 h 搬進(jìn)測(cè)試室適應(yīng)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，將大鼠放到中央?yún)^(qū)固定位置，每次放置頭部固定朝向一側(cè)。每只大鼠測(cè)量 5 min，測(cè)量指標(biāo)包括運(yùn)動(dòng)總距離、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間、中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)、直立次數(shù)及理毛次數(shù)，隨后用 75% 酒精清潔箱內(nèi)環(huán)境，等酒精揮發(fā)無(wú)味后，再進(jìn)行下 1 只。

1. 3 數(shù)據(jù)分析采用 SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件處理所得數(shù)據(jù)，以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差( x珋± s) 表示，采用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P ＜ 0. 05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

關(guān)于如何建立起較為合理的焦慮動(dòng)物模型，目前應(yīng)用的造模方法有很多種，包括: 高架十字迷宮、空瓶刺激、天敵暴露、飲水沖突等等，但是仍然存在很多不確定因素和干擾因素。應(yīng)激是精神疾病的重要基礎(chǔ)，與焦慮抑郁密切相關(guān)，慢性應(yīng)激焦慮模型可作為焦慮模型的一種。

應(yīng)激的不同時(shí)程影響動(dòng)物行為，急性應(yīng)激時(shí)，動(dòng)物的活動(dòng)增加，但是隨應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，動(dòng)物的行為活動(dòng)逐漸減少，表現(xiàn)為由興奮焦慮狀態(tài)過(guò)渡到壓抑抑郁狀態(tài)。應(yīng)激發(fā)生的不同時(shí)期( 新生期或成熟期) 以及不同時(shí)程對(duì)腦結(jié)構(gòu)功能、行為、認(rèn)知產(chǎn)生不同的效應(yīng)，這種影響與應(yīng)激所致機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌改變相關(guān)。分別于強(qiáng)迫游泳應(yīng)激第 1，3，7，14 和 28 天觀察應(yīng)激對(duì)大鼠海馬谷氨酸、天冬氨酸及 γ-氨基丁酸( gamma-aminobutyric acid，GABA) 含量的影響，結(jié)果顯示第 3 天開(kāi)始海馬興奮性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸含量持續(xù)增高，興奮性氨基酸拮抗劑 GABA 含量在急性應(yīng)激時(shí)降低，于 14 d 后開(kāi)始增高。金玉祥等的研究發(fā)現(xiàn)在不同足底電擊應(yīng)激 時(shí) 程，大 鼠 腦 內(nèi) 一 氧 化 氮 合 酶 ( nitric oxidesynthase，NOS) 表達(dá)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化: 應(yīng)激早期( 1 ～ 6d) NOS 陽(yáng)性神經(jīng)元的核團(tuán)數(shù)目增多，NOS 活性增加; 隨著應(yīng)激時(shí)程延長(zhǎng)，陽(yáng)性核團(tuán)數(shù)目逐漸減少，15d 時(shí)眾多腦區(qū)的 NOS 表達(dá)較前明顯下降。基于以上，慢性應(yīng)激焦慮模型需要把握應(yīng)激時(shí)程。焦慮與抑郁往往伴發(fā)出現(xiàn)，焦慮反應(yīng)和抑郁反應(yīng)之間可能僅僅存在一個(gè)時(shí)間跨度，短期的刺激可以導(dǎo)致焦慮，而在 此 基 礎(chǔ) 上 的 延 長(zhǎng) 刺 激 則 可 導(dǎo) 致 抑 郁 發(fā)生。比較大鼠 7 d、14 d 以及 21 d 行為學(xué)表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn) 14 d 慢性束縛應(yīng)激大鼠主要表現(xiàn)為焦慮狀態(tài)，而21 d 大鼠則主要以抑郁為主。綜合之前的各項(xiàng)研究，我們選擇 7 d 及 14 d 這兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)觀察足底電擊應(yīng)激時(shí)程對(duì)大鼠焦慮樣行為的影響。

本實(shí)驗(yàn)采用高架十字迷宮及開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)足底電擊應(yīng)激所致大鼠焦慮樣行為，基于引起焦慮因素，例如未受保護(hù)的、升高的區(qū)域或一個(gè)開(kāi)放區(qū)域，焦慮水平被表達(dá)為進(jìn)入?yún)拹簠^(qū)域的次數(shù)及逗留時(shí)間。除此以外，高架十字迷宮的入臂總次數(shù)，開(kāi)場(chǎng)的運(yùn)動(dòng)總距離及直立次數(shù)可以表征大鼠運(yùn)動(dòng)活性及探索欲望，理毛次數(shù)反映大鼠對(duì)自己的關(guān)注度，大鼠運(yùn)動(dòng)探索及自我關(guān)注的下降，一定程度上反映大鼠抑郁樣行為。已有研究表明間隔一周的兩次高架及開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)主要指標(biāo)在初測(cè)及復(fù)測(cè)實(shí)驗(yàn)中均呈較好相關(guān)性及較好復(fù)測(cè)信度，可以認(rèn)為大鼠對(duì)高架十字迷宮及開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的適應(yīng)和記憶效應(yīng)并未太大影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究足底電擊組在高架十字迷宮及開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中均顯示出對(duì)開(kāi)放區(qū)域的回避，表現(xiàn)為閉臂停留時(shí)間及進(jìn)入次數(shù)的增多，開(kāi)場(chǎng)中心區(qū)探索時(shí)間及進(jìn)入次數(shù)的減少，焦慮樣行為顯著。與此同時(shí)，入臂總次數(shù)、開(kāi)場(chǎng)運(yùn)動(dòng)總距離、直立及自我修飾次數(shù)較對(duì)照組也顯著降低，顯示明顯抑郁樣行為。比較不同造模時(shí)間，我們還觀察到隨著足底電擊應(yīng)激時(shí)程的增加，大鼠焦慮樣行為減輕，抑郁程度加重。

綜上所述，足底電擊結(jié)合孤養(yǎng)可致大鼠焦慮樣行為，可作為慢性應(yīng)激焦慮模型的一種。14 d 大鼠的焦慮程度較 7 d 有所下降，然而大鼠運(yùn)動(dòng)探索活性及自我關(guān)注度進(jìn)一步降低，抑郁樣行為增加。可以認(rèn)為足底電擊應(yīng)激焦慮模型造模時(shí)程的選擇，7 d較 14 d 更優(yōu)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果從行為學(xué)角度進(jìn)一步支持應(yīng)激時(shí)程影響動(dòng)物焦慮抑郁樣行為的觀點(diǎn)，研究應(yīng)激相關(guān)精神疾病應(yīng)重視應(yīng)激的時(shí)程、強(qiáng)度以及應(yīng)激類(lèi)型的差別，這與臨床實(shí)際情況更加接近，并且時(shí)程影響背后的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。