通過(guò)SpectraMax Paradigm微孔板檢測(cè)平臺(tái)和Tune技術(shù)可自動(dòng)掃描熒光蛋白分子來(lái)確定其最佳波長(zhǎng)
Molecular Devices公司基于SpectraMax ®Paradigm® 多功能微孔板檢測(cè)平臺(tái)的基礎(chǔ)上推出了一款使用濾光片作為其單色器，但又可隨意調(diào)節(jié)其檢測(cè)波長(zhǎng)的Tune卡盒，這種最新的檢測(cè)技術(shù)融合了濾光片的高靈敏度和波長(zhǎng)掃描的高靈活性等特點(diǎn)。Tune檢測(cè)卡盒克服了傳統(tǒng)光柵型單色器的缺陷，可以方便研究人員在更廣的波長(zhǎng)范圍內(nèi)優(yōu)化各種試驗(yàn)所需的最佳波長(zhǎng)，且檢測(cè)靈敏度也較光柵型系統(tǒng)提高了10倍以上。Tune卡盒激發(fā)光波長(zhǎng)范圍360nm至790nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍400nm至850nm，且可以做到1nm步進(jìn)，它也是一種多功能檢測(cè)卡盒，除具有熒光強(qiáng)度（FI）檢測(cè)模式外，還具有時(shí)間分辨熒光（TRF）和化學(xué)發(fā)光（Lum）檢測(cè)模式。
SpectraMax Paradigm 檢測(cè)平臺(tái)融合了全新Tune檢測(cè)技術(shù)
具有專利的光譜優(yōu)化向?qū)Чδ芸珊?jiǎn)化了工作流程，即針對(duì)不同熒光染料分子掃描后自動(dòng)計(jì)算出信號(hào)與背景的比值，找出此熒光染料分子的最佳激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)。軟件會(huì)自動(dòng)生成掃描熱圖，給出根據(jù)不同掃描波長(zhǎng)對(duì)計(jì)算后的信號(hào)與背景比值，方便用戶選擇最優(yōu)波長(zhǎng)來(lái)完成試驗(yàn)，當(dāng)使用EGFP熒光染料分子進(jìn)行波長(zhǎng)的自動(dòng)優(yōu)化設(shè)置后，其檢測(cè)靈敏度較使用傳統(tǒng)固定波長(zhǎng)的方法提高了80倍以上。
激發(fā)和發(fā)射光譜掃描
單獨(dú)針對(duì)兩個(gè)綠色熒光蛋白的突變體進(jìn)行激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)掃描，分別將重組野生型 GFP （Clontech） 和增強(qiáng)型GFP（EGFP，BioVision）都用TE緩沖液都稀釋至 10μg/ml， PH調(diào)為8 。為測(cè)量GFP樣品（50ul）光譜學(xué)特性將其加入黑色384孔板中，黑色微孔板中僅含有緩沖液的孔作為參比孔。
單獨(dú)進(jìn)行激發(fā)和發(fā)射光譜掃描時(shí)，將測(cè)量時(shí)間（Integration Time）設(shè)置為140ms。當(dāng)確定最佳激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行掃描時(shí)，首先將發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)置為530nm，激發(fā)波長(zhǎng)從360nm至500nm 且每隔2nm步進(jìn)。當(dāng)確定最佳發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行掃描時(shí)，首先激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為440nm，發(fā)射波長(zhǎng)從470nm至600nm且每隔2nm步進(jìn)。圖一中顯示出當(dāng)EGFP的發(fā)射峰在506nm（GFP）附近，即512nm(EGFP；圖一)時(shí)，其激發(fā)峰從394nm紅移至482nm。
GFP和EGFP采用Tune技術(shù)（圖一）
使用SpectraMax Paradigm微孔板檢測(cè)平臺(tái)和Tune技術(shù)在SoftMax Pro6軟件光譜掃描模式下獲得GFP和EGFP的光譜。我們從光譜中明顯發(fā)現(xiàn)它們的激發(fā)峰的最大值發(fā)生移動(dòng)，藍(lán)色線代表GFP光譜，綠色線代表EGFP光譜，虛線代表激發(fā)光譜，實(shí)線代表發(fā)射光譜
光譜優(yōu)化向?qū)Чδ?/SPAN>
使用SoftMax Pro6軟件中的光譜優(yōu)化向?qū)Чδ軄?lái)確定GFP和EGFP的最優(yōu)波長(zhǎng)，用戶可以選擇激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍，同時(shí)也可確定波長(zhǎng)步進(jìn)度。光譜優(yōu)化向?qū)軌蛲瑫r(shí)掃描激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，并計(jì)算每一對(duì)激發(fā)/發(fā)射波的信號(hào)與背景的比值，計(jì)算方法的公式為（信號(hào)-背景）/背景。結(jié)果以熱圖形式顯示出一對(duì)激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)，十字圖標(biāo)中心的位置顯示出了最高信號(hào)與背景比值，圖二為GFP掃描結(jié)果。
優(yōu)化激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)（圖二）
光譜優(yōu)化向?qū)У慕Y(jié)果可以通過(guò)熱圖的形式顯示出來(lái)，給出了GFP熒光染料分子的最佳激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，顯示GFP優(yōu)化后其最佳激發(fā)波長(zhǎng)405nm、發(fā)射波長(zhǎng)510nm，EGFP的最佳激發(fā)波長(zhǎng)465nm、發(fā)射波長(zhǎng)515nm(未顯示)
通過(guò)表一的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，使用波長(zhǎng)優(yōu)化向?qū)Чδ芎筇岣吡?/SPAN>GFP的各種突變體檢測(cè)靈敏度。GFP激發(fā)波峰與發(fā)射波峰相距112nm，靈敏度的提高得益于波長(zhǎng)優(yōu)化后適度改變了激發(fā)和發(fā)射波峰，然而EGFP激發(fā)波峰與發(fā)射波峰僅相距30nm，通過(guò)光譜優(yōu)化向?qū)Чδ苡?jì)算后可得出最佳波長(zhǎng)可以使得檢測(cè)靈敏度提高80倍，優(yōu)化后激發(fā)和發(fā)射波峰相距50nm，降低了的激發(fā)光干擾。
表一：分別通過(guò)Tune卡盒優(yōu)化波長(zhǎng)或固定激發(fā)和發(fā)射波峰，比較兩種方法針對(duì)GFP和EGFP兩種染料分子的檢測(cè)下線（LLDs）
結(jié)論
當(dāng)用戶面對(duì)全新未知的熒光染料分子進(jìn)行波長(zhǎng)優(yōu)化時(shí)，如果通過(guò)Tune卡盒的光譜優(yōu)化向?qū)Чδ懿粌H可以自動(dòng)優(yōu)化出該染料分子的最佳激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)并可以減少50%的時(shí)間。激發(fā)波長(zhǎng)范圍360nm至790nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍400nm至850nm，SpectraMax Paradigm微孔板檢測(cè)平臺(tái)加上Tune卡盒后，能夠檢測(cè)絕大多數(shù)常用的熒光染料分子，并且檢測(cè)靈敏度較傳統(tǒng)光柵型系統(tǒng)高出10倍以上。如上述試驗(yàn)所示，當(dāng)使用的熒光染料分子(如EGFP)的斯托克位移較窄時(shí)，通過(guò)Tune卡盒波長(zhǎng)優(yōu)化功能可大幅度提高試驗(yàn)檢測(cè)的靈敏度（提高80倍）。 Tune 卡盒除具有熒光強(qiáng)度檢測(cè)模式外，也提供了時(shí)間分辨熒光和化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)模式，增加了試驗(yàn)檢測(cè)方法的多樣性。
