(一)蛋白質(zhì)電泳
1.請(qǐng)參照常規(guī)電泳操作.
2.分子量標(biāo)準(zhǔn):
可選擇普通分子量標(biāo)準(zhǔn)或預(yù)染的分子量標(biāo)準(zhǔn).在選擇預(yù)染的分子量標(biāo)準(zhǔn)時(shí),要注意其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn):
優(yōu)點(diǎn): 在電泳過(guò)程中可監(jiān)控蛋白質(zhì)分離狀態(tài); 可指示轉(zhuǎn)印中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)印效率.
缺點(diǎn): 染料影響蛋白質(zhì)移動(dòng)速度;分子量測(cè)定略欠精確;影響蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合力.
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(二)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印
a) 膜的選擇:主要采用 NC膜和PVDF膜,其比較如下:


(尼龍膜和NC膜的特點(diǎn)相似,主要用于核酸雜交)
b) 膜的大小: 請(qǐng)根據(jù)膠的面積來(lái)確定.
c) 膜的孔徑: 0.45um適用一般蛋白質(zhì). 0.2um適用小分子蛋白質(zhì).
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(三) 蛋白質(zhì)的顯示(大部分實(shí)驗(yàn)不需要進(jìn)行此步操作)
蛋白質(zhì)染色的染料有很多種,各種的特點(diǎn)均不一樣.


(四)免疫檢測(cè)
有各種不同的免疫檢測(cè)方法.請(qǐng)注意選擇.方法不同,則所需的試劑也不同.如需方便,可選擇完整的試劑盒.
A.封閉膜:
這一步會(huì)影響結(jié)果的成敗和背景的強(qiáng)度.常用封閉劑為BSA和Tween20. 脫脂干奶粉不適合用于糖蛋白和生物素標(biāo)記抗體.
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B.一抗: 根據(jù)目的蛋白質(zhì)選擇.單抗或多抗均可.注意已變性蛋白質(zhì)無(wú)法檢測(cè),必須采用非變性膠電泳. 我司有 R&D, Genex, Santa Cruz等公司的原裝抗體或進(jìn)口分裝抗體.具體請(qǐng)參見(jiàn)免疫學(xué)部分產(chǎn)品----第一抗體.
C.標(biāo)記二抗: 根據(jù)一抗的來(lái)源選擇二抗.
購(gòu)買信息: 請(qǐng)參見(jiàn)免疫學(xué)部分試劑---各種標(biāo)記抗體
D.底物系統(tǒng): 采用常規(guī)底物或化學(xué)發(fā)光底物.
(1) 顯色法: 常用底物為BCIP/NBT或DAB .此法簡(jiǎn)單,但靈敏度不高,并難以從膜上去除.
(2) 化學(xué)發(fā)光法: 目前比較常用的方法.靈敏度較高,檢測(cè)時(shí)可采用X光膠片或CCD成像系統(tǒng).
不同顯色方法產(chǎn)品比較如下:


推薦產(chǎn)品:
SuperECL Plus Western Blotting 超敏發(fā)光液
采用獨(dú)特的發(fā)光底物系統(tǒng)，是世界上最靈敏的ECL Western Blot 化學(xué)發(fā)光試劑。用于Western Blotting 條帶的熒光發(fā)光，檢測(cè)直接或間接標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶HRP 的抗體及其關(guān)聯(lián)的抗原。由兩種溶液組成，使用前混合。SuperECL Plus 超敏發(fā)光液，價(jià)格低廉，靈敏度大大高出Amersham 和Santa Cruz 公司同類ECL 產(chǎn)品100 倍以上，也明顯高出Pierce 的SuperSignal West Pico 化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)數(shù)倍，但背景更干凈，發(fā)光時(shí)間持久，可以長(zhǎng)達(dá)10 小時(shí)以上。
特別適用于豐度極低而一般ECL 系統(tǒng)難于檢測(cè)的目的蛋白。
特點(diǎn)如下：
ж 靈敏度極高，可檢測(cè)10-100 fg 抗原。
ж 高信噪比，背境干凈。
ж 發(fā)光迅速。
ж 發(fā)光持續(xù)12小時(shí)以上。
ж 可在日光燈下進(jìn)行發(fā)光操作。
ж 節(jié)省抗體(一抗1:2000－1:6000；二抗1:4000－1:10000)。
ж 儲(chǔ)存條件：4℃避光儲(chǔ)存一年，偶爾室溫放置數(shù)周不影響質(zhì)量。

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美國(guó)Pierce公司化 學(xué) 發(fā) 光 底 物 系 列



4. Western Blotting檢測(cè)試劑盒
我們開(kāi)發(fā)了此步免疫檢測(cè)的完整的試劑盒,即HRP標(biāo)記的二抗檢測(cè)系統(tǒng)(含封閉液,洗液,底物,HRP/親和素-二抗),您只需準(zhǔn)備好一抗,并選擇和一抗動(dòng)物來(lái)源相應(yīng)的試劑盒就可以.對(duì)于實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō),采用完整的試劑盒可以避免各種試劑的不匹比而帶來(lái)的結(jié)果不理想.
Western Blotting DAB顯色法檢測(cè)試劑盒
試劑盒的內(nèi)容：
（1） 封閉試劑：10g蛋白質(zhì)干粉2包。
（2） 濃縮抗體稀釋液：20ml×2瓶，為10倍濃縮液。
（3） 過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗。1ml。效價(jià)1：200—400
（4） DAB濃縮液10ml(×40倍)
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注: 每盒足夠10張膜或800平方厘米的膜顯色, 表中所列動(dòng)物IgG是指一抗的種屬來(lái)源.