RBP研究技術(shù)RIP-seq+Polysome profiling
【RNA結(jié)合蛋白ARID5A驅(qū)動(dòng)IL-17依賴(lài)性自身抗體誘導(dǎo)的腎小球腎炎】
自身抗體介導(dǎo)的腎小球腎炎（AGN）是由腎臟炎癥失調(diào)引起的重大健康問(wèn)題，盡管現(xiàn)有的治療方法可以提高生存率，但效果有限，而且副作用嚴(yán)重。因此，迫切需要改進(jìn)的治療方法。IL-17在AGN中的作用已被廣泛研究，但其下游的分子信號(hào)以及調(diào)控機(jī)制仍不清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)，RNA結(jié)合蛋白ARID5A(AT-rich interactive domain-containing protein 5a)在AGN中顯著上調(diào)，并在IL-17依賴(lài)性腎臟炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
文章題目：The RNA binding protein Arid5a drives IL-17-dependent autoantibody-induced glomerulonephritis
發(fā)表期刊：Journal Of Experimental Medicine
科研團(tuán)隊(duì)：美國(guó)匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)系、免疫學(xué)系等
發(fā)表時(shí)間：2024年7月26日
主要發(fā)現(xiàn)
1. ARID5A在AGN中起關(guān)鍵作用：ARID5A通過(guò)調(diào)控IL-17依賴(lài)性炎癥反應(yīng)，驅(qū)動(dòng)AGN的病理過(guò)程。
2. ARID5A的翻譯調(diào)控功能：ARID5A通過(guò)與核糖體相互作用，增強(qiáng)關(guān)鍵炎癥轉(zhuǎn)錄因子（如C/EBPs）的翻譯，從而促進(jìn)AGN的發(fā)展。
研究意義
該研究揭示了ARID5A在IL-17依賴(lài)性腎臟炎癥中的重要作用，為開(kāi)發(fā)針對(duì)AGN的新型治療策略提供了潛在靶點(diǎn)。通過(guò)選擇性抑制ARID5A，可能在不影響宿主防御的情況下，有效控制自身免疫性腎臟疾病。
研究結(jié)果
1.ARID5A在人類(lèi)和小鼠AGN中表達(dá)升高
ARID5A在人組織中的表達(dá)：分析歐洲腎臟cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)（European Renal cDNA Bank）發(fā)現(xiàn)IL17RA mRNA在多種AGN中表達(dá)升高。類(lèi)似地ARID5A mRNA也在多種AGN（如IgA腎病、ANCA相關(guān)性腎炎等）中顯著上調(diào)。采用RNAScope原位雜交對(duì)腎組織進(jìn)行活檢，結(jié)果表明在ANCA-GN患者中ARID5A的表達(dá)也顯著升高。
ARID5A在小鼠中的表達(dá)：在Act1缺失小鼠（Act1−/−）的腎組織中ARID5A的誘導(dǎo)減弱，以及IL-17特征減少，因此ARID5A的誘導(dǎo)依賴(lài)于IL-17信號(hào)通路。與ANCA-GN患者類(lèi)似，在AGN期間的腎小管上皮細(xì)胞（RTECs）中ARID5A的表達(dá)顯著上調(diào)。因此，ARID5A主要在AGN期間的IL-17應(yīng)答性腎臟細(xì)胞中高表達(dá)。
發(fā)表期刊：Journal Of Experimental Medicine
科研團(tuán)隊(duì)：美國(guó)匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)系、免疫學(xué)系等
發(fā)表時(shí)間：2024年7月26日
主要發(fā)現(xiàn)
1. ARID5A在AGN中起關(guān)鍵作用：ARID5A通過(guò)調(diào)控IL-17依賴(lài)性炎癥反應(yīng)，驅(qū)動(dòng)AGN的病理過(guò)程。
2. ARID5A的翻譯調(diào)控功能：ARID5A通過(guò)與核糖體相互作用，增強(qiáng)關(guān)鍵炎癥轉(zhuǎn)錄因子（如C/EBPs）的翻譯，從而促進(jìn)AGN的發(fā)展。
研究意義
該研究揭示了ARID5A在IL-17依賴(lài)性腎臟炎癥中的重要作用，為開(kāi)發(fā)針對(duì)AGN的新型治療策略提供了潛在靶點(diǎn)。通過(guò)選擇性抑制ARID5A，可能在不影響宿主防御的情況下，有效控制自身免疫性腎臟疾病。
研究結(jié)果
1.ARID5A在人類(lèi)和小鼠AGN中表達(dá)升高
ARID5A在人組織中的表達(dá)：分析歐洲腎臟cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)（European Renal cDNA Bank）發(fā)現(xiàn)IL17RA mRNA在多種AGN中表達(dá)升高。類(lèi)似地ARID5A mRNA也在多種AGN（如IgA腎病、ANCA相關(guān)性腎炎等）中顯著上調(diào)。采用RNAScope原位雜交對(duì)腎組織進(jìn)行活檢，結(jié)果表明在ANCA-GN患者中ARID5A的表達(dá)也顯著升高。
ARID5A在小鼠中的表達(dá)：在Act1缺失小鼠（Act1−/−）的腎組織中ARID5A的誘導(dǎo)減弱，以及IL-17特征減少，因此ARID5A的誘導(dǎo)依賴(lài)于IL-17信號(hào)通路。與ANCA-GN患者類(lèi)似，在AGN期間的腎小管上皮細(xì)胞（RTECs）中ARID5A的表達(dá)顯著上調(diào)。因此，ARID5A主要在AGN期間的IL-17應(yīng)答性腎臟細(xì)胞中高表達(dá)。
圖1.AGN期間ARID5A在人和小鼠腎上皮中表達(dá)升高。
2.ARID5A能夠增強(qiáng)AGN病理
腎功能保護(hù)：ARID5A缺失的小鼠誘導(dǎo)AGN后，腎功能指標(biāo)（如血尿素氮BUN和肌酐）顯著低于野生型小鼠，表明ARID5A缺失能夠保護(hù)腎臟免受AGN的損害。
炎癥反應(yīng)減弱：ARID5A缺失小鼠的腎臟中，IL-17依賴(lài)性炎癥因子（如IL-6、Lcn2、Ccl2等）的表達(dá)顯著降低，且髓系細(xì)胞（如單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）的浸潤(rùn)也明顯減少。
組織病理學(xué)改善：ARID5A缺失小鼠的腎臟組織病理學(xué)評(píng)分顯著改善，異常腎小球的數(shù)量減少，表明ARID5A在AGN的病理過(guò)程中起關(guān)鍵作用。
腎功能保護(hù)：ARID5A缺失的小鼠誘導(dǎo)AGN后，腎功能指標(biāo)（如血尿素氮BUN和肌酐）顯著低于野生型小鼠，表明ARID5A缺失能夠保護(hù)腎臟免受AGN的損害。
炎癥反應(yīng)減弱：ARID5A缺失小鼠的腎臟中，IL-17依賴(lài)性炎癥因子（如IL-6、Lcn2、Ccl2等）的表達(dá)顯著降低，且髓系細(xì)胞（如單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）的浸潤(rùn)也明顯減少。
組織病理學(xué)改善：ARID5A缺失小鼠的腎臟組織病理學(xué)評(píng)分顯著改善，異常腎小球的數(shù)量減少，表明ARID5A在AGN的病理過(guò)程中起關(guān)鍵作用。
圖2. ARID5A對(duì)于AGN是必需的。
3.ARID5A調(diào)控C/EBP轉(zhuǎn)錄因子的蛋白積累
C/EBP轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)：在AGN模型中，C/EBPβ和C/EBPδ的mRNA水平在ARID5A缺失小鼠中并未顯著變化，但其蛋白水平顯著降低。這表明ARID5A主要通過(guò)調(diào)控C/EBP轉(zhuǎn)錄因子的翻譯而非轉(zhuǎn)錄來(lái)影響其表達(dá)。
IL-17誘導(dǎo)的C/EBP蛋白積累：在體外實(shí)驗(yàn)中，IL-17刺激后，ARID5A缺失的RTECs中C/EBPβ和C/EBPδ的蛋白水平顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)了ARID5A在IL-17依賴(lài)性C/EBP蛋白積累中的關(guān)鍵作用。
C/EBP轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)：在AGN模型中，C/EBPβ和C/EBPδ的mRNA水平在ARID5A缺失小鼠中并未顯著變化，但其蛋白水平顯著降低。這表明ARID5A主要通過(guò)調(diào)控C/EBP轉(zhuǎn)錄因子的翻譯而非轉(zhuǎn)錄來(lái)影響其表達(dá)。
IL-17誘導(dǎo)的C/EBP蛋白積累：在體外實(shí)驗(yàn)中，IL-17刺激后，ARID5A缺失的RTECs中C/EBPβ和C/EBPδ的蛋白水平顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)了ARID5A在IL-17依賴(lài)性C/EBP蛋白積累中的關(guān)鍵作用。
圖3. ARID5A調(diào)控C/EBP轉(zhuǎn)錄因子。
4.ARID5A結(jié)合的RNA靶點(diǎn)鑒定
RIP-Seq分析：通過(guò)RNA免疫沉淀測(cè)序（RIP-Seq），研究人員發(fā)現(xiàn)ARID5A在IL-17刺激后與多種RNA結(jié)合，其中包括炎癥相關(guān)mRNA（如CEBPD、NFKBIZ）以及核糖體RNA（rRNA）和翻譯相關(guān)RNA。
RIP-Seq分析：通過(guò)RNA免疫沉淀測(cè)序（RIP-Seq），研究人員發(fā)現(xiàn)ARID5A在IL-17刺激后與多種RNA結(jié)合，其中包括炎癥相關(guān)mRNA（如CEBPD、NFKBIZ）以及核糖體RNA（rRNA）和翻譯相關(guān)RNA。
圖4. 鑒定RTECs中ARID5A靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本。
5.ARID5A與核糖體相互作用，促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯
ARID5A與核糖體的相互作用：嘌呤霉素?fù)饺雽?shí)驗(yàn)表明ARID5A以某種方式促進(jìn)翻譯。通過(guò)蔗糖梯度離心（Polysome profiling）和免疫印跡分析，研究人員發(fā)現(xiàn)ARID5A主要與40S核糖體亞基結(jié)合，而在60S和80S核糖體中的結(jié)合較弱，表明ARID5A可能在翻譯起始階段發(fā)揮作用。熒光共聚焦成像顯示IL-17依賴(lài)的ARID5A與核糖體共定位。此外，IL-17促進(jìn)ARID5A從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)，并與40S核糖體亞基（18S rRNA）結(jié)合。ARID5A還與60S核糖體亞基（5S rRNA）有較弱的相互作用，表明ARID5A可能在翻譯起始過(guò)程中發(fā)揮動(dòng)態(tài)作用。
全局翻譯調(diào)控：ARID5A缺失的細(xì)胞中，全局蛋白質(zhì)合成顯著減少，表明ARID5A在維持細(xì)胞翻譯活性中起重要作用。
炎癥因子的翻譯增強(qiáng)：IL-17刺激后，ARID5A通過(guò)與核糖體結(jié)合，增強(qiáng)了C/EBPδ和IL-6等炎癥因子的翻譯效率，從而促進(jìn)了AGN的病理過(guò)程。
ARID5A與核糖體的相互作用：嘌呤霉素?fù)饺雽?shí)驗(yàn)表明ARID5A以某種方式促進(jìn)翻譯。通過(guò)蔗糖梯度離心（Polysome profiling）和免疫印跡分析，研究人員發(fā)現(xiàn)ARID5A主要與40S核糖體亞基結(jié)合，而在60S和80S核糖體中的結(jié)合較弱，表明ARID5A可能在翻譯起始階段發(fā)揮作用。熒光共聚焦成像顯示IL-17依賴(lài)的ARID5A與核糖體共定位。此外，IL-17促進(jìn)ARID5A從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)，并與40S核糖體亞基（18S rRNA）結(jié)合。ARID5A還與60S核糖體亞基（5S rRNA）有較弱的相互作用，表明ARID5A可能在翻譯起始過(guò)程中發(fā)揮動(dòng)態(tài)作用。
全局翻譯調(diào)控：ARID5A缺失的細(xì)胞中，全局蛋白質(zhì)合成顯著減少，表明ARID5A在維持細(xì)胞翻譯活性中起重要作用。
炎癥因子的翻譯增強(qiáng)：IL-17刺激后，ARID5A通過(guò)與核糖體結(jié)合，增強(qiáng)了C/EBPδ和IL-6等炎癥因子的翻譯效率，從而促進(jìn)了AGN的病理過(guò)程。
圖5. Arid5a促進(jìn)RTECs中的蛋白質(zhì)合成。
ARID5A功能在ST2細(xì)胞中的驗(yàn)證：在IL-17敏感的ST2細(xì)胞中，ARID5A同樣表現(xiàn)出與核糖體的相互作用，并調(diào)控炎癥因子的翻譯。RIP-Seq分析顯示，ARID5A在ST2細(xì)胞中結(jié)合的RNA靶點(diǎn)與HK-2細(xì)胞中的結(jié)果高度一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了ARID5A在IL-17信號(hào)通路中的保守功能。
圖6. Arid5a結(jié)合rRNA，促進(jìn)小鼠基質(zhì)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成。
ARID5A在AGN中的病理機(jī)制模型：IL-17刺激后，ARID5A從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)，與40S核糖體亞基結(jié)合，增強(qiáng)C/EBPδ和IL-6等炎癥因子的翻譯效率。這些炎癥因子進(jìn)一步促進(jìn)腎臟炎癥和AGN的病理過(guò)程。
圖7. Arid5a的作用模型。
研究小結(jié)
這項(xiàng)研究揭示了ARID5A在IL-17依賴(lài)性腎臟炎癥中的關(guān)鍵作用，特別是通過(guò)調(diào)控C/EBP轉(zhuǎn)錄因子的翻譯來(lái)驅(qū)動(dòng)AGN的病理過(guò)程。ARID5A的發(fā)現(xiàn)為開(kāi)發(fā)針對(duì)AGN的新型治療策略提供了潛在靶點(diǎn)，尤其是通過(guò)選擇性抑制ARID5A來(lái)阻斷IL-17信號(hào)通路，可能在不影響宿主防御的情況下有效控制自身免疫性腎臟疾病。
參考文獻(xiàn)
Yang Li, Shachi P Vyas, Isha Mehta, et al. (2024). The RNA binding protein Arid5a drives IL-17-dependent autoantibody-induced glomerulonephritis. Journal of Experimental Medicine, 221(9), e20240656. doi:10.1084/jem.20240656
這項(xiàng)研究揭示了ARID5A在IL-17依賴(lài)性腎臟炎癥中的關(guān)鍵作用，特別是通過(guò)調(diào)控C/EBP轉(zhuǎn)錄因子的翻譯來(lái)驅(qū)動(dòng)AGN的病理過(guò)程。ARID5A的發(fā)現(xiàn)為開(kāi)發(fā)針對(duì)AGN的新型治療策略提供了潛在靶點(diǎn)，尤其是通過(guò)選擇性抑制ARID5A來(lái)阻斷IL-17信號(hào)通路，可能在不影響宿主防御的情況下有效控制自身免疫性腎臟疾病。
參考文獻(xiàn)
Yang Li, Shachi P Vyas, Isha Mehta, et al. (2024). The RNA binding protein Arid5a drives IL-17-dependent autoantibody-induced glomerulonephritis. Journal of Experimental Medicine, 221(9), e20240656. doi:10.1084/jem.20240656
RBP研究方案設(shè)計(jì)：RIP-seq + Polysome profiling
1. 研究背景
RNA結(jié)合蛋白（RBP）在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起關(guān)鍵作用，影響RNA的穩(wěn)定性、定位、翻譯和降解。RIP-seq（RNA免疫共沉淀測(cè)序）和Polysome Profiling（多核糖體分析）聯(lián)合使用，可全面研究RBP與RNA的相互作用及其對(duì)翻譯的影響。
2. 研究目標(biāo)
RNA結(jié)合蛋白（RBP）在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起關(guān)鍵作用，影響RNA的穩(wěn)定性、定位、翻譯和降解。RIP-seq（RNA免疫共沉淀測(cè)序）和Polysome Profiling（多核糖體分析）聯(lián)合使用，可全面研究RBP與RNA的相互作用及其對(duì)翻譯的影響。
2. 研究目標(biāo)
- 鑒定特定RBP結(jié)合的RNA分子。
- 分析RBP對(duì)RNA翻譯效率的影響。
- 探索RBP在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的機(jī)制。
3. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
3.1 實(shí)驗(yàn)材料
3.1 實(shí)驗(yàn)材料
- 細(xì)胞系：選擇目標(biāo)RBP高表達(dá)的細(xì)胞。
- 抗體：針對(duì)目標(biāo)RBP的特異性抗體。
3.2 實(shí)驗(yàn)步驟
3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理
3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理
- 培養(yǎng)目標(biāo)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
- 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求處理細(xì)胞（如藥物處理、基因敲除/過(guò)表達(dá)等）。
3.2.2 RNA免疫共沉淀（RIP）
- 細(xì)胞裂解：收集細(xì)胞，使用裂解緩沖液裂解。
- 免疫沉淀：加入RBP特異性抗體，孵育后與蛋白A/G磁珠結(jié)合，捕獲RBP-RNA復(fù)合物。
- 洗滌：洗滌磁珠，去除非特異性結(jié)合。
- RNA提取：解離RBP-RNA復(fù)合物，提取RNA。
3.2.3 Polysome Profiling
- 細(xì)胞裂解：收集細(xì)胞，使用裂解緩沖液裂解。
- 蔗糖梯度離心：制備蔗糖梯度，超速離心分離多核糖體。
- 分部收集：收集不同密度的多核糖體組分。
- RNA提取：從各組分中提取RNA。
3.2.4 RNA-seq
- RNA質(zhì)量檢測(cè)：檢測(cè)RNA質(zhì)量。
- 建庫(kù)：使用RNA-seq建庫(kù)試劑盒構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。
- 測(cè)序：進(jìn)行高通量測(cè)序（如Illumina平臺(tái)）。
3.2.5 數(shù)據(jù)分析
- 數(shù)據(jù)預(yù)處理：去除低質(zhì)量reads和接頭序列。
- 比對(duì)：將reads比對(duì)到參考基因組。
- 差異表達(dá)分析：比較RIP-seq和Polysome Profiling數(shù)據(jù)，識(shí)別RBP結(jié)合的RNA及其翻譯效率變化。
- 功能注釋?zhuān)簩?duì)差異表達(dá)的RNA進(jìn)行GO和KEGG通路分析。
4. 預(yù)期結(jié)果
- 鑒定出RBP結(jié)合的靶RNA。
- 分析RBP對(duì)RNA翻譯效率的影響。
- 揭示RBP在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的潛在機(jī)制。
5. 研究意義
- 全面解析RBP的功能及其對(duì)RNA翻譯的調(diào)控機(jī)制。
- 提供RBP在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的新見(jiàn)解。
- 為相關(guān)疾病機(jī)制研究和治療靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。
標(biāo)簽：
Polysome profiling
- 客戶(hù)文章（Plant Com) DAP-seq助力揭示甘藍(lán)型油菜早花的遺傳機(jī)制
- 利用建庫(kù)篩選與單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)CAR信號(hào)模塊搭建進(jìn)行研究
- Ribo-seq技術(shù)原理與應(yīng)用方向
- RBP研究技術(shù)RIP-seq+Polysome profiling
- Cell文獻(xiàn)：轉(zhuǎn)座子外顯化構(gòu)成了一個(gè)受進(jìn)化選擇的功能蛋白質(zhì)亞型儲(chǔ)庫(kù)
- 二代測(cè)序在腫瘤方向的發(fā)展
- 超聲法與酶切法在二代測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建中的應(yīng)用
- Mol Plant文章DAP-seq技術(shù)助力客戶(hù)挖掘水稻香氣調(diào)控機(jī)制
- 森西賽智亮相中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)2025年全國(guó)大會(huì)
- 森西賽智科技受邀亮相第七屆病毒腫瘤學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議
- 怡美通德誠(chéng)邀您參加CCTB 2025腫瘤標(biāo)志物學(xué)術(shù)大會(huì)
- 中山大學(xué)王鵬教授榮獲安捷倫ACT-UR研究基金支持
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- 怡美通德邀您參加第三屆國(guó)際單細(xì)胞及空間組學(xué)大會(huì)
- 10x Genomics技術(shù)方案更新(2月)，新手冊(cè)等您獲取
- 2025中國(guó)細(xì)胞與基因治療大會(huì)第五屆年會(huì)招展通知
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