Keywords：原代肝細胞；Primary Hepatocytes; 肝細胞分離；肝細胞提取; Hepatocyte Isolation Protocol；Isolation of Primary Hepatocytes

肝臟作為藥物暴露的主要器官，在藥物的代謝和毒性過程中起著至關(guān)重要的作用。原代肝細胞（Primary Hepatocytes）具有完整的細胞特性和生理水平的酶和輔助因子，既包括膜結(jié)合酶【如細胞色素P450（Cytochrome P450）混合功能氧化酶】，也包括胞質(zhì)酯酶，擁有肝臟中所有的代謝途徑。因此，原代肝細胞（Primary Hepatocytes）被廣泛認為是構(gòu)建體外肝臟模型的金標準，在藥物相互作用、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的青睞。
一、原代肝細胞分離方法
肝細胞分離（Isolation of Primary Hepatocytes）和肝細胞提取提取有直接剪切法、組織塊培養(yǎng)法、胰蛋白酶消化法、兩步膠原酶灌注法（Seglen灌注法）、半原位膠原酶灌注法等。

【直接剪切法】
原理：將肝臟切成小塊，然后用膠原酶或胰蛋白酶進行消化，分離得到肝細胞。
優(yōu)點：操作簡單，適用于大量細胞的分離。
缺點：細胞損傷較大，純度較低。

【組織塊培養(yǎng)法】
原理：將肝臟切成小塊，在培養(yǎng)皿中加入含特定生長因子的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，使組織塊貼壁生長，然后逐漸分離得到肝細胞。
優(yōu)點：能夠保持細胞的天然狀態(tài)，適用于長期培養(yǎng)。
缺點：操作較為繁瑣，細胞數(shù)量較少。

【胰蛋白酶消化法】
原理：用胰蛋白酶或胰酶對肝臟進行消化，分離得到肝細胞。
優(yōu)點：能夠較為徹底地分解細胞間物質(zhì)，獲得較純的肝細胞。
缺點：胰蛋白酶的價格較貴，成本較高。

【兩步膠原酶灌注法（Seglen灌注法）】
原理：用含有膠原酶的溶液通過門靜脈灌注到肝臟中，使肝實質(zhì)細胞與間質(zhì)分開，然后收集分離得到肝實質(zhì)細胞。
優(yōu)點：能夠保持細胞的天然狀態(tài)，適用于長期培養(yǎng)。
缺點：操作較為繁瑣，細胞數(shù)量較少。

【半原位膠原酶灌注法】
原理：將肝臟放置在特定裝置中，通過門靜脈灌注膠原酶溶液，使肝臟在生理狀態(tài)下進行消化，然后收集分離得到肝實質(zhì)細胞。
優(yōu)點：能夠較為真實地模擬生理狀態(tài)，獲得的細胞形態(tài)、活性較好。
缺點：操作較為復(fù)雜，成本較高。
其中，兩步膠原酶灌流法因其對肝細胞損傷作用較小，肝細胞產(chǎn)率和存活率高，成為了分離原代肝細胞的經(jīng)典方法。

二、原代肝細胞分離流程
鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引領(lǐng)者，在兩步膠原酶灌注的基礎(chǔ)上，開發(fā)了原代肝細胞分離試劑盒，有標準的分離流程（Hepatocyte Isolation Protocol），其內(nèi)整合了包括灌流液、膠原酶、細胞洗滌液、細胞純化液、試驗耗材等在內(nèi)的所有組分，可適用于大鼠、小鼠等多個種屬原代肝細胞的分離。以下為詳細實驗流程：

1、實驗材料
1)動物：空白健康的6~8周雄性SD大鼠
2)儀器：恒溫水浴鍋、水平離心機、移液器、生物安全柜
3)試劑：膠原酶、灌流溶液A、灌流溶液B、消化終止液、分離液添加劑、肝細胞純化液
4)耗材：0.22um過濾器、20ml無菌注射器、10ml無菌注射器、5ml無菌注射器、無菌紗布、無菌剪刀、無菌鑷子、無菌燒杯、無菌擦手紙、無菌50mL離心管及巴氏吸管

2、試劑預(yù)處理
1)灌流溶液A：實驗前37℃水浴預(yù)熱30分鐘。
2)灌流溶液B：實驗前每100mL灌流溶液B中加入1支膠原酶，充分溶解后用0.22µm過濾器過濾。過濾后的溶液加入100uL分離液添加劑，然后37℃水浴預(yù)熱30分鐘。
3)消化終止液：實驗前在無菌條件下，每100mL消化終止液中加入100uL分離液添加劑，混勻后置于冰上備用。

3、實驗步驟及結(jié)果
(一)  肝臟獲取
1)盡可能于半分鐘內(nèi)將大鼠斷頸處死后用75%酒精噴灑進行全身消毒，并轉(zhuǎn)移至生物安全柜中。
2)用鑷子將大鼠下腹部皮膚提起，并使用剪刀從下往上將大鼠腹部表皮剪開，以裸露腹部肌肉部位。
3)更換剪刀將大鼠肌肉部位剪開，使肝臟充分暴露，注意不要將大鼠內(nèi)臟器官剪破。

(二)  組織處理
1)用剪刀剪開圖A所示位置，剪至能清晰可見每葉肝臟上都有較為明顯的靜脈孔，使用20mL注射器從靜脈孔處灌注灌流液A，將每葉肝臟都灌注至土黃色。 2)使用10mL注射器從靜脈孔處灌注灌流液B，直至肝臟軟爛。

(三)  細胞獲取
1)用鑷子將肝臟摘下置于含10mL灌流溶液B液的50mL離心管中并用剪刀將其充分剪碎至泥狀，補加灌流溶液B至30mL.
2)37℃水浴消化約3min,期間用巴氏吸管不斷攪拌。 3)消化結(jié)束后按照混懸液與消化終止液1：1的比例加入消化終止液。
4)無菌紗布過濾即得肝細胞懸液。

(四)  細胞洗滌
1)將肝細胞懸液輕輕顛倒混勻，分裝至50mL離心管。
2)70g（升速 3、降速 3）、4℃離心 5min。
3)在超凈工作臺中棄上清，消化終止液重懸細胞沉淀。
(五)   細胞純化
1)按照 7：3 的比例（即細胞懸液：肝細胞純化液）加入肝細胞純化液并混勻。
2)100g（升速 3、降速 3）、4℃離心 10min。
3)棄上清，使用凍存液將細胞重懸，并于液氮罐中保存。 如圖所示，該圖為IPHASE技術(shù)人員此次共分離得到的SD大鼠新鮮肝細胞照片，經(jīng)0.4%臺盼藍染色后發(fā)現(xiàn)細胞活率在90%以上，且數(shù)量共有80million，說明以IPHASE原代肝細胞分離試劑盒為提取材料，可獲得純度高、活率好且數(shù)量多的新鮮原代肝細胞！

三、IPHASE相關(guān)產(chǎn)品
IPHASE作為體外研究生物試劑引領(lǐng)者，深刻識到原代肝細胞（Primary Hepatocytes）是構(gòu)建體外肝臟模型的金標準，在藥物相互作用、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的廣泛青睞。因此，在兩步膠原酶灌注法的基礎(chǔ)上研發(fā)了原代肝細胞分離試劑盒，在標準的肝細胞分離流程（Hepatocyte Isolation Protocol）下進行肝細胞分離（Isolation of Primary Hepatocytes）和肝細胞提取，并以SD大鼠為實例，證明該試劑盒、該方法具有實用性！除此以外，IPHASE以相似分離流程，研發(fā)、生產(chǎn)了多種屬、多規(guī)格及多性別的懸浮或貼壁原代肝細胞，供客戶購買使用，為客戶縮短時間，節(jié)約成本！

產(chǎn)品	種屬	規(guī)格
原代肝細胞分離試劑盒	多種屬	1套
新鮮/凍存懸浮肝細胞	人/猴/犬/大鼠/小鼠/貓/豬/兔/雞/金黃地鼠	2/5 miliion
新鮮/凍存貼壁肝細胞	人/猴/犬/大鼠/小鼠/貓/豬/兔	2/5 miliion
培養(yǎng)基	復(fù)蘇/鋪板/維持/代謝	10/20/50 mL
膠原包被板	6/12/24/48/96孔	1/5塊
超低吸附培養(yǎng)板平底	6/12/24/48/96孔	1/5 個
超低吸附培養(yǎng)板U底	96孔	1/5 個

IPHASE生產(chǎn)產(chǎn)品均具有以下優(yōu)勢：
合規(guī)性：生產(chǎn)產(chǎn)品的組織均由正規(guī)渠道獲得，來源清晰。
安全性：生產(chǎn)組織均經(jīng)過病原檢測，保證產(chǎn)品質(zhì)量安全。
高質(zhì)量：生產(chǎn)產(chǎn)品均經(jīng)過嚴格的內(nèi)部質(zhì)控，且同批次數(shù)量多，批次間差異性小。
可定制：可根據(jù)客戶特殊需求，提供特殊種屬肝細胞的定制服務(wù)。


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