本文要點：本研究通過創(chuàng)新設計合成具有新型骨架Cy15s的NIR-II熒光團，成功將吲哚菁聚甲炔的發(fā)射波長紅移至1200 nm以上，顯著提升了生物成像的對比度和穿透深度。開發(fā)了簡單且模塊化的四步合成路線，為臨床成像劑的優(yōu)化提供了重要參考。Cy15s在二氯乙烷（DCM）中表現出最高1287 nm的發(fā)射波長和117.1 M−1cm−1的亮度，是現有1200 nm以上發(fā)射聚甲炔熒光團亮度的6倍。低細胞毒性和優(yōu)異光學特性使其能夠實現高信噪比的NIR-IIb血管成像和長期原位腫瘤成像。

本研究提出了一種新的合成策略，涉及穩(wěn)定的中間體和整體的4步合成路線，以構建Cy15 熒光團。如方案 1B 所示，通過 Vilsmeier-Haack 反應，戊二烯衍生物可以輕松高效地從環(huán)酮合成。通過將戊二烯醛與苯并吲哚衍生物縮合，獲得了氯取代醛。通過可選的Suzuki 偶聯反應，獲得了單官能醛2。然后，以酮為連接單元，通過高效的羥醛縮合定量合成具有15碳鏈的化合物3。最后，通過簡單的金屬有機反應，例如 Grignard 反應，高效合成了吸收峰超過1,200 nm、發(fā)射峰超過1,250 nm的Cy15熒光團。

方案1. 吲哚菁聚甲炔熒光團的合成工藝

1上的初始氯化物可以很容易地被取代（R1）改變聚甲辛鏈的電子和空間特性。通過使用各種有機金屬試劑，不同的烷基或芳基（R2）可以連接到共軛鏈的中心。此外，聚甲辛主鏈上的環(huán)（表示為環(huán) A 和 B）可以定制以控制Cy15的構象，從而影響彎曲角度和扭轉角度等參數。通過這些方法，研究者成功合成了10個具有不同取代基和構象的Cy15熒光團，命名為SJ系列（SJ-1174、SJ-1246、SJ-1249、SJ-1260、SJ-1268、SJ-1269、SJ-1271、SJ-1275、SJ-1277 和 SJ- 1287）。圖 2A、2B顯示了 Cy15 在 DCM 中的歸一化吸收和發(fā)射光譜。Cy15s 在 NIR-II 區(qū)域表現出很強的吸收能力，具有高達 2.5 × 105M−1·cm−1 的高摩爾吸收系數 （ε）和0.048%熒光量子產率 （ΦF），優(yōu)于發(fā)射波長超過 1,200 nm 的其他聚甲辛。Cy15s 的斯托克斯位移 （54-63 nm） 大約是 Cy7-Cy11 系列 （28-37 nm） 的兩倍，也高于其他 NIR-II 聚甲嘧啶的斯托克斯位移。

圖2. Cy15s 的化學結構和光譜

簡而言之，共軛鏈上的吸電子取代導致波長紅移，而電子供體修飾導致Cy15 的藍移和量子產率增加。摻入更多的 5 元環(huán)導致波長顯著增加，而量子產率則合理降低。增強的空間位阻也提高了量子產率。Cy15s 的最大吸收波長范圍為1128 至 1241 nm，而最大發(fā)射波長范圍為1174至1287 nm。量子產率（范圍從0.010% 到0.048%）和高摩爾消光系數（高達2.6 × 105M−1·cm−1） 有助于實現高達117.1 M−1·cm−1的亮度，比發(fā)射波長超過 1,200 nm 的聚甲辛熒光基團的最佳性能高6倍。

圖3. Cy15s 膠束的構建和表征

PBS 中 SJ-1249-MICELLES和 SJ-1271-膠束的歸一化吸收和發(fā)射光譜表明，盡管在水相中吸收展寬，但最大吸收和發(fā)射波長與有機相中的波長相似（圖3B）。首先評估膠束中 Cy15s 的不同重量分數。由動態(tài)光散射 （DLS） 確定的尺寸分布和 zeta 電位 （-12.33 mV） 證實了膠束的成功制備。有趣的是，增加染料負載導致更小的納米顆粒尺寸。SJ-1271-膠束在 0.25% 染料負載下的平均直徑為 ∼112 nm，在 5.0% 染料負載下減小到 ∼48 nm。同樣，SJ-1249-MICELLES在 0.5% 染料負載量下顯示直徑為 ∼90 nm，在 5.0% 染料負載量下顯示直徑為 ∼56 nm。值得注意的是，SJ-1249-MICELLES（1%）和SJ-1271-膠束（0.5%）的低染料載量表現出最高的熒光強度（圖3C）。然而，較高的染料載量導致熒光強度降低，這可能是由于較小膠束中聚集引起的猝滅（ACQ）效應增強。在相同吸光度下，在808 nm 激光激發(fā)下，SJ-1249-MICELLES在 PBS 中表現出與ICG相比顯著優(yōu)越的光穩(wěn)定性（A808= 0.6）。具體來說，SJ-1249-MICELLES保留了其初始強度的80%，而ICG下降到22%（圖3D）。當在相同濃度（1.747×10−4mol/L），SJ-1271-膠束和SJ-1249-MICELLES在PBS和生理鹽水中均顯示出比ICG更好的光穩(wěn)定性，分別保留了其初始強度的87%和76%，而ICG的強度下降到40%。

在磷酸鹽緩沖液（PBS）中，使用相同摩爾濃度、激發(fā)激光波長（808 nm）和功率密度（60 mW/cm²），通過不同長通濾波器（LP 1100、LP 1300和LP 1500）對SJ-1271-膠束、SJ-1249-MICELLES和ICG的亮度進行了比較。結果表明，在LP 1300下，SJ-1249-MICELLES和SJ-1271-膠束的亮度分別比ICG高5.1倍和4.1倍；在LP 1500下，它們的亮度分別比ICG高9.6倍和5.1倍（圖3E和4F）。SJ-1249-MICELLES在超過1500 nm的波長下展現出更高的亮度，使其成為NIR-IIb成像的有力候選者。

圖4. NIR-II血管系統體內成像

接下來，對小鼠進行NIR IIb體內血管成像。使用不同長通濾波器（LP 1100、LP 1300和LP 1500）對后肢血管進行成像比較，結果顯示，使用LP 1500成像相比LP 1100和LP 1300實現了更高的信噪比（SNR）和更低的半高全寬（FWHM）值（圖4A和S19）。在LP 1500下，黃點虛線處編號為1、2和3的三條血管清晰可辨，其最大信噪比分別為3.79、2.86和5.99，半高全寬分別為351微米、209微米和895微米（血管1-3）。相比之下，中間的血管（血管2）在LP 1100和LP 1300下幾乎難以分辨。LP 1500下優(yōu)異的信噪比和半高全寬可歸因于NIR-IIb波段組織散射的減少。

為了進一步比較SJ-1249-MICELLES和ICG在后肢成像中的效果，研究者進行了詳細的對比實驗。結果顯示，使用SJ-1249-MICELLES時，股動脈和股靜脈清晰可辨，其最大信噪比（SNR）分別為5.80和5.07，半高全寬（FWHM）分別為387微米和532微米（圖4C，血管1和2）。相比之下，ICG成像僅顯示一個峰值，信噪比為1.51，半高全寬為508微米（圖4B，血管1）。此外，SJ-1249-MICELLES還能識別出五條毛細血管，其最大信噪比分別為6.79、5.00、4.33、5.96和4.33（圖4C，血管3-7）。而使用ICG成像只能識別出四條毛細血管，且信噪比較低，分別為1.37、1.40、1.57和1.52（圖4B，血管2-5）。在腹部的NIR-IIb成像中，可以識別出三條毛細血管，其最大信噪比分別為2.90、2.67和3.39，半高全寬分別為196微米、472微米和385微米（圖4D，血管1-3）。腦血管成像顯示，中央血管的最大信噪比為5.37（血管2），并識別出三條毛細血管，其最大信噪比分別為3.87（血管1）、2.12（血管3）和1.82（血管4）（圖4E）。這些高信噪比的血管成像結果突顯了新型吲哚氰多甲基熒光染料Cy15s在NIR-IIb成像中的巨大潛力。

圖5. 原位4T1荷瘤小鼠的NIR-II成像

通過將 4T1 細胞植入 Balb/c 裸鼠的乳腺脂肪墊中建立了原位乳腺腫瘤模型。隨后，通過尾靜脈注射將SJ-1249-Micelles 注入荷瘤小鼠體內，并進行時間依賴性的近紅外二區(qū)（NIR-II）成像（圖5A）。增強的滲透性和滯留（EPR）效應使得腫瘤與正常組織之間的差異更加明顯，這是因為腫瘤中微球的滯留量更大，導致熒光強度更高。值得注意的是，在注射后觀察到腫瘤有強烈的熒光，即使在注射后72小時也能檢測到腫瘤周圍的血管。測量了腫瘤與正常組織的比率（TNR）以及正常組織隨時間變化的熒光強度（圖5B）。SJ-1249-Micelles 的熒光信號每24小時下降到原來的75%，半衰期為2.4天，而TNR在注射后 6 小時達到峰值，高達3.0，并在72小時后保持在1.9。SJ-1249-Micelles在腫瘤中的超長灌注時間表明其具有長期監(jiān)測的能力，這對于進一步的體內應用具有優(yōu)勢。這種延長的滯留時間能夠有效追蹤腫瘤的動態(tài)變化以及對治療的反應，從而增強對腫瘤進行綜合縱向研究的潛力。這些特性使得 SJ-1249-Micelles 成為癌癥研究和治療監(jiān)測中持續(xù)評估的有前途的工具。此外，在注射 SJ-1249-Micelles 后 6 小時進行的NIR-II成像測量了腫瘤的信噪比（SNR），揭示了高達4.76的最大SNR（圖5C）。還使用1208 nm激光激發(fā)和1500 nm長通濾波器進行了腫瘤及其周圍血管的NIR-IIb成像。腫瘤和血管很容易區(qū)分，可以識別出腫瘤附近的四條毛細血管，最大SNR達到2.44。SJ-1249-Micelles 在腫瘤和毛細血管的無創(chuàng) NIR-II 成像方面顯示出巨大的潛力。

本文構建了一種新的吲哚氰多甲烯熒光染料Cy15s支架，其最大吸收波長超過1200 nm，發(fā)射波長超過1280 nm，是目前吲哚氰多甲烯類中最長的。開發(fā)了一種整體4步的模塊化簡潔合成路線，用于合成十五甲烯吲哚氰熒光染料Cy15s。新的共軛鏈允許通過改變彎曲角和旋轉角進行多次修飾，從而調節(jié)分子結構，使最大發(fā)射波長從1174 nm調節(jié)到1287 nm，與計算化學研究結果高度一致，并且實現了高達117.1 M−1⋅cm−1的顯著亮度。得益于水溶性微球的低細胞毒性和良好的吸收發(fā)射光譜，分別獲得了小鼠后肢、腹部和大腦的NIR-IIb血管成像，信噪比（SNR）分別為6.79、3.39和5.37。原位4T1腫瘤荷載小鼠的NIR-II成像顯示，腫瘤和腫瘤周圍毛細血管可以被識別，具有高達3.0的腫瘤與正常組織比（TNR）和4.76的信噪比（SNR）。本研究為共軛鏈提供了一種新的支架，為NIR-II探針的設計和合成開辟了新途徑。這一創(chuàng)新增強了深層組織成像能力和腫瘤研究。本研究的方法和發(fā)現可為未來研究提供重要參考，特別是在優(yōu)化成像劑以用于臨床應用以及通過先進的成像技術改善對腫瘤生物學的理解方面。

參考文獻

Ge R T, Xiong F, Chen Z B, et al. Indocyanine polymethine fluorophores with extended π-conjugation emitting beyond 1,200 nm for enhanced NIR-II imaging[J]. Chem, 2025.

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