嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）療法在腫瘤治療領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展，而慢病毒載體（Lentiviral Vector, LV）作為基因遞送系統(tǒng)的核心原材料，其下游純化工藝的優(yōu)化直接關(guān)系到治療的安全性和經(jīng)濟(jì)性。本文系統(tǒng)綜述了LV下游純化工藝的三大階段——澄清過濾、純化與精純滅菌的技術(shù)進(jìn)展，重點(diǎn)探討切向流過濾（TFF）的應(yīng)用策略，分析膜材料選擇、工藝參數(shù)控制對(duì)LV活性與回收率的影響，并提出規(guī)模化生產(chǎn)中面臨的挑戰(zhàn)與未來研究方向。
 
CAR-T療法與慢病毒載體的重要性
CAR-T療法通過基因工程改造患者T細(xì)胞實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)抗腫瘤效應(yīng)，其臨床療效已在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中取得顯著突破。然而，CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)工藝復(fù)雜，其中慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)節(jié)成本占比高達(dá)30%-50%，且LV的活性與純度直接影響CAR-T細(xì)胞的功能與安全性。因此，構(gòu)建高效、穩(wěn)定且符合GMP要求的LV下游純化工藝，成為推動(dòng)CAR-T療法產(chǎn)業(yè)化的核心課題。

 

慢病毒載體下游純化的三大步驟
慢病毒的活性受到工藝過程中溫度、pH、鹽濃度、滲透壓以及剪切力的影響，因此在下游純化過程中需要格外關(guān)注這些條件對(duì)慢病毒載體活性的影響。

澄清過濾旨在去除細(xì)胞培養(yǎng)液中的細(xì)胞碎片及大顆粒雜質(zhì)（>1 μm）。當(dāng)前主流的工藝結(jié)合低速離心（<5000×g）與深層過濾技術(shù)，通過錯(cuò)流設(shè)計(jì)可有效降低濾器堵塞風(fēng)險(xiǎn)，尤其適用于中試及以上規(guī)模的連續(xù)處理。例如，采用孔徑為0.45-1.2 μm的聚醚砜（PES）深層濾膜，可高效截留顆粒污染物并減少80%以上的宿主細(xì)胞蛋白（HCP）負(fù)載量，為后續(xù)純化階段奠定高質(zhì)量基礎(chǔ)。

適用于LV中度純化的策略主要包括層析和切向流過濾。切向流過濾（TFF）中的超濾滲濾（UFDF）是慢病毒載體（LV）大規(guī)模純化和濃縮以及緩沖液置換的關(guān)鍵步驟。
在UFDF過程中，病毒顆粒被濃縮的同時(shí)，分子量小于膜孔徑的雜質(zhì)（如DNA）會(huì)隨透過液被有效去除。從工藝流程的角度來看，TFF既可以在澄清后階段應(yīng)用，通過濃縮減少后續(xù)層析步驟的料液體積，也可以在中度純化和精純之間使用，通過緩沖液置換調(diào)節(jié)樣品的pH和電導(dǎo)率，從而為后續(xù)層析操作創(chuàng)造有利條件。
由于LV容易失活，工藝過程中需要嚴(yán)格控制剪切力、通量、跨膜壓和操作時(shí)間等參數(shù)，并選擇合適的膜材料和孔徑，以確保LV的活性。適用于LV純化的膜材料包括聚醚砜（PES）和再生纖維素（RC）。此外，膜孔徑的選擇也至關(guān)重要：孔徑越大，雜質(zhì)清除率越高，但可能導(dǎo)致LV回收率下降。因此，需要根據(jù)具體工藝條件選擇最合適的膜材料和孔徑。

適用于LV精純的策略主要有SEC（尺寸排阻色譜）以及TFF（切向流過濾）。通過TFF進(jìn)一步濃縮，供需要更高濃度病毒的群體使用。不過高剪切力（>5000 s⁻¹）與跨膜壓（TMP>1.5 bar）易導(dǎo)致LV衣殼破裂，需通過動(dòng)態(tài)壓力控制將通量維持在20-40 LMH以維持活性。最后進(jìn)行無菌過濾，通常選用0.22μm的濾膜進(jìn)行過濾進(jìn)行灌裝。

▲Oxford BioMedica為諾華Kymriah代工的慢病毒制造流程（圖片來源：Molecular Therapy）

當(dāng)前挑戰(zhàn)和未來方向
盡管LV純化技術(shù)已取得顯著進(jìn)展，仍存在以下瓶頸：

為進(jìn)一步提升LV生產(chǎn)的可及性與經(jīng)濟(jì)性，未來研究可聚焦于：

慢病毒載體（LV）下游純化是CAR-T療法產(chǎn)業(yè)化的核心環(huán)節(jié)，而切向流過濾（TFF）的應(yīng)用顯著提升了LV的純度和回收率。然而，膜污染、工藝穩(wěn)定性及冷鏈依賴仍是主要挑戰(zhàn)。未來，通過新材料開發(fā)、連續(xù)流工藝優(yōu)化和凍干技術(shù)創(chuàng)新，有望進(jìn)一步突破技術(shù)瓶頸，推動(dòng)CAR-T療法從實(shí)驗(yàn)室走向更廣泛的臨床應(yīng)用。