熒光標(biāo)記的超分辨顯微成像技術(shù)，以其高分辨率、特異性強、可實時動態(tài)觀察等優(yōu)點，成為了探索生物醫(yī)學(xué)現(xiàn)象和作用機制的重要工具。然而，固定、染色等處理過程不僅繁瑣，還可能對樣品的生物結(jié)構(gòu)與活性產(chǎn)生干擾。與此同時，無標(biāo)記顯微成像技術(shù)因能避免這些處理，也逐漸受到關(guān)注。

研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
在細胞生物學(xué)研究中，成像技術(shù)一直是不可或缺的工具。傳統(tǒng)的寬場熒光顯微鏡受到光學(xué)衍射極限的限制，無法滿足研究者對細胞超微結(jié)構(gòu)觀察的需求。20世紀末至21世紀初，多種超分辨顯微成像技術(shù)應(yīng)運而生，其中結(jié)構(gòu)光照明超分辨顯微技術(shù)（SIM）因其較低的光漂白性和光毒性、較高的成像速度，成為主流的超分辨顯微成像技術(shù)之一，尤其適合活細胞長時間成像。然而，固定和染色等處理過程不僅繁瑣，還可能對樣品的生物結(jié)構(gòu)與活性造成干擾，并且存在光漂白和光毒性等問題。

而在無需熒光染料的情況下對樣品進行觀察的無標(biāo)記顯微成像技術(shù)，雖然其分辨率通常低于超分辨熒光顯微技術(shù)，且無法實現(xiàn)特定結(jié)構(gòu)的可視化，但無侵入性、簡單便捷、能夠進行長時間活體實驗是其主要優(yōu)勢，因此一些無標(biāo)記顯微成像技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床診斷和分子醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。隨著生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究需求日益多樣化，單一成像模式已難以滿足科研人員的需求，成像模式的擴展變得尤為重要，因此結(jié)合多種成像模態(tài)的顯微成像系統(tǒng)的研究意義重大。

技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
SIM與ROCS的原理與結(jié)合
結(jié)構(gòu)光照明超分辨顯微技術(shù)（SIM）的原理是通過余弦形式的結(jié)構(gòu)光照明將樣品的高頻信息編碼至低頻區(qū)域，采集原始圖像后對高頻分量進行分離和拼接，通過拓展圖像頻譜實現(xiàn)超分辨成像。旋轉(zhuǎn)相干散射顯微成像技術(shù)（ROCS）則是通過使用相位型空間光調(diào)制器（SLM）產(chǎn)生多個方向的斜照明光束照射樣品，以照明光束完成360°的掃描為一個照明周期，在一個照明周期內(nèi)相機保持持續(xù)曝光收集樣品散射光，從而實現(xiàn)高分辨和高對比度的相干光無標(biāo)記成像。結(jié)合SIM和ROCS這兩種不同類型的成像方法，搭建了SIM-ROCS雙模態(tài)顯微成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以在兩種模式之間進行任意切換，既具備超分辨熒光顯微成像功能，又具備高分辨率無標(biāo)記成像功能，為細胞生物學(xué)的研究提供了新的工具。

系統(tǒng)搭建與硬件設(shè)計
所搭建的SIM-ROCS雙模態(tài)顯微成像系統(tǒng)主要由照明光路、熒光探測路和散射探測路三部分組成。照明光路中，激光器發(fā)出的線偏光經(jīng)過一系列光學(xué)元件的處理后，通過空間濾波器（mask）進行空間濾波，根據(jù)成像模式的不同需求設(shè)計不同的mask，實現(xiàn)不同的空間濾波功能。在熒光探測路中，經(jīng)物鏡聚焦的結(jié)構(gòu)光照射在樣品上，激發(fā)熒光信號，依次通過物鏡、二向色鏡、發(fā)射濾光片等元件后在相機的靶面成像。而散射探測路則用于無標(biāo)記ROCS成像，經(jīng)物鏡聚焦的激光照射在樣品上激發(fā)散射光，依次通過物鏡、二向色鏡、光闌等元件后在相機的靶面成像。此外，系統(tǒng)中各模式涉及的不同器件之間的時序同步和觸發(fā)設(shè)計也是關(guān)鍵，通過現(xiàn)場可編程門陣列（FPGA）進行整體觸發(fā)控制，使系統(tǒng)達到微秒級精度的時序同步與控制，確保整個系統(tǒng)高效、正確地采集所需的圖像。

成像實驗與結(jié)果分析
熒光微球標(biāo)準樣品成像分析
通過使用100nm的熒光微球標(biāo)準樣品對SIM-ROCS雙模態(tài)顯微成像系統(tǒng)進行測試，在SIM和ROCS通道分別得到了111nm和145nm的空間分辨率。通過對單個微球圖像沿中心的強度展開進行高斯擬合求取其半峰全寬（FWHM），得到SIM通道的空間分辨率為111.4nm，寬場熒光通道的分辨率為254.6nm，ROCS通道的高斯擬合后的FWHM為290.9nm。同時，通過瑞利判據(jù)和圖像頻譜寬度的倒數(shù)測量，ROCS系統(tǒng)的分辨率為145nm。

在同一視野下對200nm的熒光微球樣品分別進行普通寬場熒光成像、SIM超分辨成像和ROCS散射成像，并對感興趣的區(qū)域放大，結(jié)果顯示在普通寬場圖像中無法分辨的兩個熒光微球，在ROCS圖像中得以區(qū)分，說明ROCS成像模式有效提高了圖像的分辨率。此外，對于可分辨的微球，ROCS模式下的強度分布有兩個非常明確的峰值，可以對兩個微球進行分辨，且ROCS圖像中兩點之間的距離比實際距離略寬，與理論相符。同時，ROCS模式在提高鄰近物體之間的對比度方面也表現(xiàn)出色，峰值與谷值之間相差更大，有利于對圖像進行分析和處理。

PANC-1胰腺癌細胞樣品成像分析
對PANC-1胰腺癌細胞樣品，使用熒光探針對其進行染色，并在ROCS和寬場熒光模式下對該樣品進行成像。結(jié)果顯示，寬場熒光和ROCS圖像視野內(nèi)的PANC-1細胞尖端有著較為清晰的偽足結(jié)構(gòu)，并且對于細胞邊界和偽足，ROCS圖像的對比度高于寬場熒光圖像。沿偽足部分做強度分布的展開，ROCS圖像對于偽足這一結(jié)構(gòu)的分辨率、對比度和信噪比均優(yōu)于寬場熒光圖像，邊界清晰明顯，更有利于對樣品進行觀察和分析。

此外，作為相干光無標(biāo)記成像方法，ROCS在獲得較高信噪比時所需的光劑量與熒光通道相比非常微小，光毒性更低。對PANC-1胰腺癌細胞的成像結(jié)果體現(xiàn)了ROCS對于偽足結(jié)構(gòu)的成像優(yōu)勢，以及它在成像過程中所需光功率極小、光毒性遠低于熒光成像的特點。

總結(jié)與展望
根據(jù)SIM和ROCS兩種成像方法在原理和系統(tǒng)上的異同點設(shè)計并搭建了SIM-ROCS雙模態(tài)成像系統(tǒng)，實現(xiàn)了超分辨熒光和無標(biāo)記成像功能的集合。通過對熒光微球標(biāo)準樣品和PANC-1胰腺癌細胞樣品在不同通道下的成像結(jié)果進行分析，驗證了該系統(tǒng)的可行性和有效性。該系統(tǒng)在對標(biāo)準樣品成像的實驗中性能表現(xiàn)良好，但在對生物樣品的成像實驗中由于樣品和器件的限制，在熒光通道出現(xiàn)了信噪比偏低的現(xiàn)象，沒有取得理想的成像結(jié)果。在將來的工作中，可以通過對樣品和熒光染料的對比選擇以及對分光器件和探測方案的優(yōu)化，在保證ROCS通道成像質(zhì)量的前提下進一步提高熒光通道的性能。此外，還可以開展由ROCS到SIM跨模態(tài)圖像翻譯的相關(guān)工作，探索更多成像技術(shù)的融合與創(chuàng)新，為細胞生物學(xué)的研究提供更加強大的成像工具，助力生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究取得更多的突破和進展。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來源于：孫瑋, 劉更亮, 文剛, 陳曉虎, 梁永, 李輝. 結(jié)構(gòu)光照明超分辨熒光與旋轉(zhuǎn)相干散射雙模態(tài)成像[J]. 激光與光電子學(xué)進展, 2024, 61(20): 2011022. 

doi:10.3788/LOP241204.