研究背景：

心源性猝死（SCD）在心血管疾病死亡中占比較高，惡性室性心律失常是其常見病因，由心肌在結構或功能壓力下發(fā)生的結構和電生理重塑引起。以往研究顯示：線粒體功能障礙與心律失常發(fā)生相關，ATP合成減少、ROS生成增加會引發(fā)細胞和離子功能異常從而導致心律失常。ROS通過氧化并激活Ca²⁺/鈣調素依賴性激酶II（CaMKII）誘發(fā)心律失常。曾有報道表明Pak1激活的信號通路可保護心肌細胞免受缺血和肥大應激，其引發(fā)的肌膜和線粒體功能失調可能成為改善心律失常的治療靶點。

新研究發(fā)現Pak2參與心臟穩(wěn)態(tài)的細胞調節(jié)，是離子通道活性、鈣處理和心臟收縮的關鍵。心臟特異性缺失Pak2的小鼠在內質網應激或壓力超負荷時會出現內質網應激反應缺陷、心臟功能障礙和心肌細胞死亡，基因芯片分析顯示這涉及IRE1/XBP1信號通路。而誘導Pak2激活可改善內質網功能和心臟性能，減少細胞凋亡并預防心力衰竭，這些發(fā)現暗示Pak2介導的內質網應激調節(jié)在心肌肥厚中具有心臟保護作用。

當前缺失Pak2在線粒體氧化應激和心臟損傷中保護作用的直接證據，基于此，西南醫(yī)科大學譚曉秋/雷鳴/張春祥教授團隊在Advanced Science雜志發(fā)表題為"P21-Activated Kinase 2 as a Novel Target for Ventricular Tachyarrhythmias Associated with Cardiac Adrenergic Stress and Hypertrophy"的文章，揭示了Pak2在心臟腎上腺素應激和肥厚相關的室性心律失常中的關鍵作用和干預價值，Pak2是開發(fā)新型有效抗心律失常藥物的潛在靶點。

研究方法：
本研究通過高分辨熒光標測（optical mapping）技術比較Langendorff灌注的Pak2^cko 和Pak2^f/f 心臟及心肌細胞的APD、CaT等電生理指標的變化；此外，同時對不同組小鼠心臟電交替、異位搏動、折返激動等現象進行監(jiān)測。

研究結果：
1. Pak2缺失破壞Ca²⁺穩(wěn)態(tài)并增加室性心律失常的易感性
探究在急性異丙腎上腺素誘導的心臟腎上腺素能應激和慢性TAC致心室肥厚情況下，Pak2信號傳導對心室致心律失常傾向的保護作用。對比Pak2缺失（Pak2^cko）和Pak2^f/f小鼠在有無TAC應激時體內外心臟電穩(wěn)定性和鈣離子處理情況。結果顯示，正常狀態(tài)下兩組小鼠部分心電指標相似，但Pak2^cko小鼠QT間期延長；急性異丙腎上腺素應激下，Pak2^cko小鼠室性心動過速發(fā)生率更高；TAC處理5周后，Pak2表達下調，且Pak2^cko/TAC小鼠心臟肥厚和功能障礙更嚴重，室性異位搏動和VT/VF發(fā)生次數增多，同時其總體生存率因Pak2缺乏和TAC刺激聯合作用而顯著降低。

圖1. 心臟Pak2的缺失增加了小鼠在急性異丙腎上腺素或慢性TAC刺激下的心律失常易感性

進一步通過高分辨熒光標測（optical mapping）及膜片鉗等技術，比較了Langendorff灌注的Pak2^cko和Pak2^f/f心臟及心肌細胞的電生理變化。基礎狀態(tài)下兩組心臟室性心律失常發(fā)生率無差異，但急性異丙腎上腺素刺激使Pak2^cko心臟VT發(fā)生率增加，且 Pak2^cko/TAC心臟室性心律失常發(fā)生率更高。

Pak2^cko及Pak2^cko/TAC心臟和心肌細胞的APD和CaT增加。TAC和Pak2缺失使鈣交替發(fā)生率和頻率增加，且加劇了異丙腎上腺素對鈣交替頻率的影響，同時Pak2缺乏加劇了TAC誘導的Vm/CaT延遲增加。Pak2^cko/TAC心臟出現APD交替，引發(fā)異位搏動、折返激動及折返路徑形成，且不同異位搏動位點會改變動作電位傳導方向，形成折返性心律失常路徑。

圖2. 心臟Pak2的缺失加劇了TAC處理后離體心臟室性心律失常和鈣交替的易感性

2. Pak2過表達可緩解異丙腎上腺素或TAC誘導的心律失常
作者構建了可誘導心臟特異性過表達野生型Pak2的小鼠Pak2^ctg模型。超聲心動圖顯示該模型和對照小鼠心臟功能正常。Pak2^ctg小鼠經異丙腎上腺素刺激后，室性心律失常發(fā)生率和持續(xù)時間降低；TAC處理7周，對照小鼠室性異位搏動頻率大幅增加，而Pak2^ctg/TAC組小鼠室性異位搏動頻率顯著降低，且Pak2激活抑制了壓力超負荷誘導的心肌肥厚。

在電生理和鈣離子相關指標上，Pak2^ctg/TAC心臟未出現如Pak2^cko心臟類似的膜電位、鈣離子光學標測重構以及鈣交替，而WT/TAC心臟則顯示出有折返激動形成、折返現象以及異常鈣離子處理與膜電位耦合的特征。

圖3. 心臟特異性Pak2過表達可減弱異丙腎上腺素或TAC誘導的心律失常和Ca²⁺交替發(fā)生

3. 分離的單個Pak2^cko心室肌細胞表現出異常的鈣離子動態(tài)變化
接下來，作者研究了Pak2^cko、Pak2^cko/TAC、Pak2^f/f和Pak2^f/f/TAC心室肌細胞中的Ca²⁺瞬變。急性異丙腎上腺素和慢性5周TAC刺激心臟中的Pak2^cko肌細胞比相應的對照組顯示出更高的自發(fā)Ca²⁺瞬變（SCT）和Ca²⁺振蕩（CO）的發(fā)生率。此外，Pak2^cko/TAC心肌細胞顯示Ca²⁺瞬變衰減時間常數明顯延長。

圖4. Pak2的缺失加重了異丙腎上腺素和TAC誘導的心臟細胞內鈣穩(wěn)態(tài)的破壞

4. Pak2^cko心臟中線粒體生物合成缺陷和氧化磷酸化
為了確定潛在的信號通路，作者對Pak2^cko、Pak2^cko/TAC、Pak2^f/f和Pak2^f/f/TAC小鼠的心室組織進行了蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學分析。

多組比較發(fā)現大量差異表達蛋白與心臟應激相關，Pak2^cko/TAC小鼠應激相關蛋白水平升高。KEGG和GO富集分析顯示Pak2^cko/TAC心臟氧化磷酸化相關代謝途徑富集。進一步分析表明不同組間蛋白質和磷酸化蛋白質有顯著差異及部分重疊，且蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學變化存在顯著相關性，對差異蛋白富集分析后發(fā)現氧化磷酸化和三羧酸循環(huán)通路相關蛋白在兩種組學中的表達趨勢高度一致。

研究運用WGCNA（加權基因共表達網絡分析） 方法探究與樣本表型相關的蛋白質及磷酸化蛋白質模塊。對四組蛋白質組學數據預處理后，構建加權網絡并經層次聚類分析得到五個蛋白質模塊，這些模塊以不同的顏色命名，如藍色模塊，黃色模塊等，其中青綠色模塊與表型嚴重程度顯著相關。對其進行KEGG和GO通路富集分析，發(fā)現與心肌病、氧化磷酸化等過程有關。同樣用該方法分析磷酸化蛋白質模塊，經層次聚類得到18個模塊，青綠色模塊與表型嚴重程度顯著相關，富集分析顯示其與心肌病和三羧酸循環(huán)有關。

圖5. Pak2缺失加重了TAC誘導的心臟氧化應激

本研究對不同組（Pak2^f/f/TAC、Pak2^cko/TAC及相應假手術組）的氧化應激、線粒體結構和功能進行探究。發(fā)現TAC誘導的慢性心臟應激使 Pak2^f/f/TAC和Pak2^cko/TAC組ROS水平顯著高于假手術組，且Pak2^cko/TAC組ROS水平高于 Pak2^f/f/TAC組。通過透射電鏡觀察到 Pak2^cko/TAC心肌細胞線粒體結構異常更突出，同時該組ATP生物合成顯著減少，與線粒體形態(tài)變化相符。

通過差異蛋白質組學分析發(fā)現，與應激相關的蛋白質在線粒體中最為富集。對比不同組小鼠，Pak2^cko/TAC小鼠線粒體中差異蛋白數量與其他組存在差異。進一步分析顯示，Pak2^cko/TAC心臟的線粒體電子傳遞鏈復合物I-V顯著少于其余三組，且其復合物I （NDUFs）的表達和活性顯著下調。同時表明，單獨的Pak2缺乏不足以導致明顯的損傷。

5. NOX4/ROS介導的CaMKII通路激活有助于Pak2在TAC誘導的心臟電重構中的作用
電生理實驗發(fā)現細胞內鈣離子動態(tài)、膜電位-鈣信號耦連異常，進一步對比不同組心臟中相關蛋白表達。結果顯示，Pak2^cko/TAC心臟中NOX4顯著增加，不同組NOX2表達相似；Pak2^cko/TAC小鼠的ox-CaMKII、p-CaMKII表達和ROS水平高于Pak2^cko小鼠，Pak2^f/f/TAC小鼠也高于Pak2^f/f小鼠，且Pak2基因敲除加劇異丙腎上腺素刺激對NOX4、CaMKII和ROS產生的影響。測量耗氧率發(fā)現，TAC處理降低了氧氣消耗率（OCR），Pak2基因敲除加重了TAC誘導的線粒體功能障礙。

圖6. Pak2缺失通過損害線粒體功能從而加重心功能障礙

6. Pak2過表達可挽救異丙腎上腺素和TAC誘導的線粒體結構和功能損傷
對比Pak2^ctg、Pak2^ctg/TAC、Pak2WT和Pak2WT/TAC的實驗表明，與Pak2^cko相比，Pak2過表達減少了ROS的產生，改善了TAC引起的線粒體變化。Pak2^ctg/TAC心肌細胞顯示線粒體異常數量減少。作者研究了NOX4/ROS/CaMKII通路可能參與Pak2過表達的心臟保護作用。Pak2^ctg/TAC心肌細胞的NOX4、ox-和p/t-CaMKII表達低于Pak2WT/TAC心肌細胞。最后，即使在異丙腎上腺素濃度加倍的情況下，急性異丙腎上腺素激發(fā)的Pak2^ctg心臟中ROS生成和p-CaMKII表達的增加也低于Pak2WT，表明Pak2過表達可能通過 NOX4/ROS/CaMKII信號通路發(fā)揮心臟保護作用。

圖7. 心臟特異性Pak2過表達可緩解TAC或異丙腎上腺素誘導的心臟氧化應激和線粒體結構異常

7. Pak2激活劑JB2019A可緩解急性異丙腎上腺素刺激和慢性TAC誘導的心肌肥厚的促心律失常作用，減少線粒體結構損傷和ROS的產生
為了研究Pak2作為治療心肌肥厚和心律失常的新靶點的可行性，作者開發(fā)了小分子Pak2激活劑JB2019A，其劑量依賴性激活Pak2。通過軟件對接發(fā)現它結合于Pak2自抑制結構域內位點，JB2019A誘導Pak2的變構改變，穩(wěn)定其活性形態(tài)，Western blotting證實其能增加磷酸化Pak2表達。在急性腎上腺素能和慢性TAC應激條件下，JB2019A激活Pak2的增加減少了心律失常和心臟重構。在急性異丙腎上腺素刺激下，能顯著降低Pak2^f/f 小鼠VT發(fā)生率，但對Pak2^cko小鼠影響較小。

圖8. Pak2激活劑JB2019A可減輕TAC誘導的心肌肥厚、降低室性心律失常的易感性

在野生型心臟中，TAC刺激顯著增加室性異位搏動發(fā)生率，JB2019A可使其明顯降低。JB2019A能改善TAC誘導的心肌肥厚，單獨使用時對心肌細胞橫截面積和HW/BW比值無影響。超聲心動圖表明JB2019A可挽救TAC導致的心臟功能障礙。此外，JB2019A處理可減少氧化應激，降低ROS水平和線粒體結構變化，抑制TAC誘導的ox-CaMKII增加，對CaMKII信號通路的抑制或能抵御氧化應激和線粒體損傷，提供抗心律失常的潛在靶點。

最后，作者檢測了人類心臟組織中Pak2和NOX4的表達，發(fā)現與竇性心律患者相比，接受體外循環(huán)的房顫患者心房附件組織中Pak2表達下降，NOX4表達升高 。

圖9. Pak2激活劑JB2019A可減輕TAC誘導的心臟氧化應激和線粒體結構異常

結論：
綜上，本研究首次揭示了Pak2在心臟應激和肥厚相關室性心律失常中的保護作用。Pak2通過調控線粒體功能和ROS生成，維持細胞內鈣穩(wěn)態(tài)，從而減少心律失常的發(fā)生。Pak2激動劑JB2019A的開發(fā)為未來抗心律失常藥物的研發(fā)提供了新的方向。