α-淀粉酶檢測試劑盒(CERALPHA METHOD)K-CERA使用說明書
α-淀粉酶檢測試劑盒(CERALPHA METHOD)K-CERA
每個試劑盒100/200 次檢測
引言
每個試劑盒100/200 次檢測
AOAC方法2002.01
AACC方法22-02.01
ICC 標準 No. 303
引言
微生物α-淀粉酶在谷物制品中淀粉的改性以及谷物加工中應(yīng)用廣泛。 微生物α-淀粉酶在谷物制品中淀粉的改性以及谷物加工中應(yīng)用廣泛。谷物及其制品中內(nèi)源性α-淀粉酶的水平對這些商品的工業(yè)利用具有顯著影響。在面包制作中，α-淀粉酶的水平必須足夠產(chǎn)生可被酵母吸收和利用的糖類，但又不能過高，否則會導致淀粉過度糊精化，從而引起面包內(nèi)部粘稠和加工問題。在釀造行業(yè)，麥芽α-淀粉酶的水平是一個關(guān)鍵的質(zhì)量參數(shù)。α-淀粉酶還作為青貯飼料添加劑使用，以幫助分解淀粉，從而為細菌生長提供可發(fā)酵的糖類。細菌、真菌和谷物α-淀粉酶都可以使用淀粉酶 HR 試劑進行測定，但測定條件（特別是 pH 值）需要根據(jù)每種特定酶進行調(diào)整。淀粉酶 HR 試劑專用于α-淀粉酶。該底物絕對抵抗外切酶（如β-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶和α-葡萄糖苷酶）的水解。
原理：
Ceralpha 法（使用淀粉酶 HR 試劑）測定α-淀粉酶的程序，采用“非還原端阻斷的對硝基苯基麥芽庚糖苷”（BPNPG7）作為底物，在過量的耐熱α-葡萄糖苷酶（由于“阻斷基團”的存在，該酶對天然底物無作用）存在的情況下進行。內(nèi)切作用的α-淀粉酶水解寡糖后，混合物中過量的α-葡萄糖苷酶會立即將對硝基苯基麥芽糖苷片段定量水解為葡萄糖和游離對硝基苯酚。測定格式見“測定原理”（第 17 頁），測定的線性關(guān)系見圖 1（第 11 頁）。本質(zhì)上，將谷物面粉提取
物或發(fā)酵液的樣品在特定條件下與底物混合物孵育，然后通過加入弱堿溶液終止反應(yīng)（并顯色）。在 400 nm 處測量吸光度（以前的文獻值為 410 nm，但實際吸收峰在 400 nm）（見第 12 頁，圖 4），該吸光度與樣品中α-淀粉酶的水平直接相關(guān)。
淀粉酶 HR 試劑混合物可用于定量測定谷物、真菌和細菌α-淀粉酶。用耐熱α-葡萄糖苷酶替代原始 Ceralpha 試劑混合物中的淀粉葡萄糖苷酶和酵母α-葡萄糖苷酶后，該測定法現(xiàn)在可以在更寬的 pH 范圍（5.2 至 7.0）和高達 60°C 的溫度下使用。使用這種新試劑，谷物α-淀粉酶的最佳活性 pH 為 5.2-5.4（見圖 7，第16 頁）。此外，在此 pH 范圍內(nèi)，使用淀粉酶 HR 試劑測得的谷物α-淀粉酶活性值與使用 Ceralpha 試劑（含有淀粉葡萄糖苷酶和α-葡萄糖苷酶）在 pH 5.2 測得的活性值基本相同。使用阻斷對硝基苯基麥芽庚糖苷作為底物的試劑混合物無法區(qū)分真菌、谷物和細菌來源的α-淀粉酶。
準確性：
專一性：
準確性：
標準誤差通常小于 5%。
試劑盒組成：
適用于進行 100/200 次檢測的試劑盒由 Megazyme 提供，包括：
1. 完整的測定方法
2. 凍干的 BPNPG7 和耐熱α-葡萄糖苷酶
3. 濃縮提取緩沖液
4. 濃縮終止試劑
5. 標準麥芽粉
專一性：
該方法對α-淀粉酶具有絕對特異性
表 1： Ceralpha 法測定小麥粉α-淀粉酶的重復性
表 1： Ceralpha 法測定小麥粉α-淀粉酶的重復性
a 分別在四天內(nèi)對單一提取物進行重復分析。b基于對每個樣本均值方差的匯總估計。單個觀測值的標準差(用于比較同一天和不同天)=0.189
c.v.(%)=4.05。
c.v.(%)=4.05。
附帶的底物：
阻斷對硝基苯基麥芽庚糖苷（BPNPG7，54.5mg）
熱穩(wěn)定α-葡萄糖苷酶(pH 6.0 時為 125U),每瓶。
將一瓶的全部內(nèi)容物溶于 10.0 mL 蒸餾水中, 等分為 2-3mL，冷凍儲存。在 0-5°C 時,溶解的底物可穩(wěn)定保存 7 天；冷凍狀態(tài)下可穩(wěn)定保存至少 12 個月。
附帶的麥芽粉：
標準化α-淀粉酶活性的麥芽粉(如小瓶標簽上所注明)
建議用戶至少標準化一批自己的小麥粉或麥芽粉，作為二級質(zhì)控樣參考。
建議用戶至少標準化一批自己的小麥粉或麥芽粉，作為二級質(zhì)控樣參考。
附帶的溶液：
(1)濃縮提取緩沖液：
1 M 蘋果酸（Buffer A）
1 M 氯化鈉
40 mM 氯化鈣
0.1%疊氮化鈉
將全部內(nèi)容物（50 mL）（以及可能出現(xiàn)的結(jié)晶沉淀）稀釋至 1000 mL 蒸餾水中后使用。在 0-5°C 下可穩(wěn)定保存 12 個月。pH 應(yīng)為 5.4；如有必要請調(diào)整。
(2)濃縮終止試劑：
(20%[w/v]磷酸三鈉 溶液，pH 約為 11)用蒸餾水將全部內(nèi)容物(25mL)稀釋至 500 mL，室溫下可穩(wěn)定保存 3 個月。
額外提取緩沖液的制備：
A. 緩沖液 A（用于谷物和真菌α-淀粉酶）：
蘋果酸(Sigma M0875; 1 M) 134.1g/L
氫氧化鈉 70 g/L
氯化鈉 58.4 g/L
二水氯化鈣 (40mM) 5.9 g/L
疊氮化鈉(Sigma S2002; 0.1 % ) 1.0 g/L
將蘋果酸、氯化鈉和氫氧化鈉加入 800 mL 蒸餾水中，冷卻至室溫后加入氯化鈣。通過逐滴加入氫氧化鈉（4 M）或鹽酸（4 M）將 pH 調(diào)整至 5.4，然后加入疊氮化鈉。調(diào)整體積至 1 L。儲存于室溫。使用時，將 50 mL 濃縮緩沖液稀釋至 1 L。
注意
在加入疊氮化鈉之前，先將試劑溶解并調(diào)整 pH 至 5.4。將疊氮化鈉加入酸性溶液中會產(chǎn)生有毒氣體。蘋果酸和富馬酸粉末具有刺激性，應(yīng)小心處理。
B. 緩沖液 B（用于芽孢桿菌屬α-淀粉酶）：
馬來酸(Sigma M0375; 0.1 M) 23.2g/2L
氯化鈉 11.6 g/2L
二水氯化鈣(2mM) 0.6 g/2L
疊氮化鈉(Sigma S2002;0.01%w/v) 0.2 g/2L
將馬來酸和氯化鈉加入 1600mL 蒸餾水中，用 4M(160g/L)氫氧化鈉調(diào)節(jié) pH 至6.5。加入氯化鈣和疊氮化鈉，調(diào)節(jié)體積至 2L。儲存于室溫。
直接使用此緩沖液，無需進一步稀釋。
直接使用此緩沖液，無需進一步稀釋。
一些細菌α-淀粉酶在稀釋后不穩(wěn)定。通常通過在緩沖液中加入 BSA(0.5mg/mL)
來解決這個問題。
額外終止試劑的制備：
將 10 克磷酸三鈉(無水)溶解在 1L 蒸餾水中，調(diào)整 pH 至約 11.0。在室溫下可穩(wěn)定保存至少 3 個月。
設(shè)備(推薦):
1. 玻璃試管(12mL 和 20mL 容量 ) 。
2. 移液器，0.1 和/或 0.2mL (例如：Gilson Pipetman®）來分配酶提取液和底物。
3. 可調(diào)容積分配器：
- 0-10mL (用于提取緩沖液)。
- 0-5mL (用于終止試劑)。
4. 正位移移液器，例如 Eppendorf Multipette®
- 配備 5.0mL Combitip®(用于分配 0.5 mL 的濃縮酶溶液)。
- 配備 25 mL Combitip®（用于分配各種體積的稀釋緩沖液）。
5. 托盤天平
6. 設(shè)定在 400 nm 的分光光度計。
7. 渦旋混合器(可選)。
8. 恒溫水浴，設(shè)定在 40℃。
9. 秒表。
10. 臺式離心機或 Whatman GF/A 玻璃纖維濾紙圓片（直徑 9 cm）。
控制與預防措施：
1. α-淀粉酶是所有體液中含量較高的酶。因此，建議在處理和分配底物混合物時使用一次性手套。
2. 溶解 Ceralpha 底物混合物所用的水必須是高純度的。如果沒有新鮮蒸餾水，可將水煮沸后冷卻至低于 30°C 再使用。洗瓶中的藻類生長會產(chǎn)生足夠的α-淀粉酶，顯著降低溶解在這種水中試劑的長期穩(wěn)定性。
3. 凍干底物在室溫下非常穩(wěn)定，但溶解后在使用期間應(yīng)于 0-5°C 保存，不使用時應(yīng)低于-10°C 保存。如果一次測定的樣本數(shù)量有限，建議將底物分成 2-3mL 的等分，冷凍保存。
4. 在 0-5°C 下保存時，空白吸光度值會在 5 天內(nèi)從 0.03 增加到約 0.05。這不會影響底物的性能，但顯然這些值必須在測定進行時同時確定。即使空白吸光度值高達 0.50，也不會影響測定的可靠性和準確性。
注意：
對于每批被分析的樣品，通常只需一個反應(yīng)空白。 要獲得此空白值，將 3.0 mL終止試劑加入 0.2 mL 底物溶液中，然后加入 0.2 mL 酶制劑。
5. 所用的分光光度計應(yīng)使用對硝基苯酚標準液在 1%磷酸三鈉中進行標準化（εmM = 18.1）。對硝基苯酚溶液（10 mM）可從 Sigma Chemical Company獲得（產(chǎn)品編號 N7660）。將該溶液稀釋 200 倍后，在 1%磷酸三鈉中于400 nm 處的吸光度為 0.905。
6. 測定時應(yīng)使用附帶的麥芽粉標準樣。該面粉的酶活性顯示在附帶的標簽上。
7. 小麥粉的提取時間應(yīng)嚴格控制在 15-20 分鐘。對于麥芽粉樣品，最佳提取時間也是 15-20 分鐘。
有用的提示：
1. 如果某個特殊測定的吸光度值大于 1.20，酶提取液應(yīng)用適當?shù)木彌_液稀釋并重新測定。
液體制劑：
分析程序：
2. 如果將所有試劑的體積減半，并使用半微量分光光度計比色皿，則試劑盒可
進行的測定次數(shù)可增加一倍。
酶提取：
A. 小麥和大麥面粉：
1. 將小麥、大麥或其他谷物（約 10-50 g 樣品）磨碎至通過 0.5 mm 篩（例如使
用 Fritsch 離心磨） 。
2. 準確稱取 3.0 g 面粉，放入 50 mL 容量的燒瓶中。
3. 向每個燒瓶中加入 20.0 mL 提取緩沖液（pH 5.4），并劇烈攪拌燒瓶內(nèi)容物。
4. 在 40°C 下提取酶 15-20 分鐘，期間偶爾攪拌。
5. 通過 Whatman GF/A 玻璃纖維濾紙過濾部分溶液，或以 1,000 g 離心 10 分鐘。在 2 小時內(nèi)測定酶活性。
B. 麥芽粉：
1. 將麥芽（20 g 樣品）磨碎至通過 0.5 mm 篩。
2. 準確稱取 0.5 g 麥芽粉，放入 100 mL 容量瓶中。
3. 向容量瓶中加入 1%氯化鈉、0.02%氯化鈣和 0.02%疊氮化鈉的溶液，并調(diào)整體積。
4. 在室溫下提取酶 15-20 分鐘，期間偶爾攪拌。
5. 通過 Whatman GF/A 玻璃纖維濾紙過濾部分溶液，或以 1,000 g 離心 10 分鐘。
6. 用提取緩沖液稀釋 0.5 mL 濾液至 9.5 mL。在 2 小時內(nèi)測定酶活性（見第 6頁 A 部分第 5 點）。
C. 微生物制劑：
液體制劑：
1. 使用正位移分配器，將 1 mL 液體酶制劑加入 49 mL 緩沖液 A 或 B（pH 5.4或 6.5）中，充分混合。這稱為原始提取液。
2. 取 1.0 mL 原始提取液，加入 9.0 mL 適當?shù)木彌_液（A 或 B）中，充分混合。重復此步驟，直至獲得適合測定的稀釋度。例如，對于工業(yè)酶制劑（如愛爾蘭 Kerry Ingredients 的細菌α-淀粉酶），原始提取液需稀釋約 4,000 倍。
粉末制劑：
1. 將 1g 酶粉制劑加入 50mL 的緩沖液 A 或 B(pH 5.4 或 6.5)中，輕輕攪拌約 15分鐘，直至樣品完全分散或溶解。2. 通過離心(1000 g，10 分鐘)或 WhatmanNo.1（直徑 9 cm）濾紙過濾澄清該溶液（即原始提取液）。3. 取 1.0 mL 該溶液，加入 9.0 mL 適當?shù)奶崛?稀釋緩沖液中，充分混合。重復此步驟，直至獲得適合測定的稀釋度。
分析程序：
A. 小麥和大麥面粉：
1. 將 0.2mL 的淀粉酶 HR 試劑溶液(未緩沖)分配到試管中，并將試管及內(nèi)容物在 40°C 下預孵育 5 分鐘。
2. 將谷物提取液在 40°C 下預孵育 5 分鐘。
3. 向每個含有 0.2 mL 淀粉酶 HR 試劑溶液的試管中，直接在試管底部加入 0.2mL 預平衡的小麥或大麥提取液。在 40°C 下孵育 20 分鐘（從加入時間開始計時）。
4. 在 20 分鐘孵育期結(jié)束后，準確加入 3.0 mL 終止試劑，并劇烈攪拌試管內(nèi)容
物。
5. 在 400 nm 處讀取溶液和反應(yīng)空白的吸光度，以蒸餾水為對照。
B. 麥芽和微生物制劑：
1. 將 0.2mL 的淀粉酶 HR 試劑溶液(未緩沖)分配到試管中，并將試管及內(nèi)容物在 40°C 下預孵育 5 分鐘。
2. 將緩沖后的麥芽或微生物制劑提取液在 40°C 下預孵育 5 分鐘。
3. 向每個含有 0.2 mL 淀粉酶 HR 試劑溶液的試管中，直接在試管底部加入 0.2mL 預平衡（并適當稀釋）的微生物酶或麥芽提取液。在 40°C 下孵育 10 分鐘（從加入時間開始計時）。
4. 在 10 分鐘孵育期結(jié)束后，準確加入 3.0 mL 終止試劑，并劇烈攪拌試管內(nèi)容物。
5. 在 400 nm 處讀取溶液和反應(yīng)空白的吸光度，以蒸餾水為對照。
酶活計算：
一個活性單位定義為在過量耐熱α-葡萄糖苷酶存在的情況下，每分鐘從BPNPG7 釋放一微摩爾對硝基苯酚所需的酶量，稱為 Ceralpha 單位（CU）。單位/克面粉：
其中：
ΔA400
=反應(yīng)吸光度−空白吸光度
孵育時間
=麥芽和微生物制劑提取液：10 分鐘
=小麥和大麥提取液：20 分鐘
比色皿中的總體積 =3.4 mL
測定的樣品體積
=0.2 mL
對硝基苯酚在 1%磷酸三鈉中的摩爾吸光系數(shù)εmM（在 400 nm 處）= 18.1
提取體積=
小麥和大麥：每 3 克 20 mL
麥芽：每 0.5 克 100 mL
微生物制劑：每 1 克或 1 mL 50 mL
稀釋倍數(shù)
=原始提取液的稀釋倍數(shù)（麥芽提取液為 20 倍）
因此：
A. 對于小麥和大麥：
單位(CU)/克面粉：
單位(CU)/克面粉：
B. 對于麥芽：
單位(CU)/克磨碎麥芽：
C. 對于微生物制劑：
單位(CU)/ mL 或 g 原始制劑：
其中：
ΔA400
=反應(yīng)吸光度−空白吸光度
孵育時間=10 分鐘
比色皿中的總體積 =3.4 mL
測定的樣品體積=0.2 mL
對硝基苯酚在 1%磷酸三鈉中的摩爾吸光系數(shù)εmM（在 400 nm 處）= 18.1
提取體積=每 1 克 50 mL (或 49 mL 加 1 mL 濃縮酶液)
稀釋倍數(shù)=原始提取液的稀釋倍數(shù)
附錄：
A. Ceralpha 測定法與酶濃度和孵育時間的線性關(guān)系
圖 1. Ceralpha 測定法與麥芽α-淀粉酶在蘋果酸鈉緩沖液（pH 5.4）中的線性關(guān)系。測定使用了四種濃度的酶（1 倍、2 倍、3 倍和 4 倍）。反應(yīng)通過加入磷酸三鈉（3.0 mL，1% w/v）在不同時間終止。
B.耐熱α-葡萄糖苷酶濃度對測定的α-淀粉酶值的影響
從圖 2 的結(jié)果可以看出，底物溶液中飽和反應(yīng)所需的α-葡萄糖苷酶濃度為 12U/mL。
圖 2. 耐熱α-葡萄糖苷酶在底物試劑溶液中的濃度對測定吸光度值的影響。
將試劑的等分試樣在 60°C 下孵育 0-20 分鐘，冷卻至室溫后用于在 40°C 下測定真菌α-淀粉酶。
從圖 2 的結(jié)果可以看出，底物溶液中飽和反應(yīng)所需的α-葡萄糖苷酶濃度為 12U/mL。
圖 2. 耐熱α-葡萄糖苷酶在底物試劑溶液中的濃度對測定吸光度值的影響。
C. 試劑混合物在 60℃下的穩(wěn)定性。
通過將試劑溶液的等分試樣在 60°C 下孵育 0-20 分鐘來確定試劑溶液的穩(wěn)定性。這些溶液隨后用于測定真菌α-淀粉酶的活性（在 40°C 下進行）。從圖 3 的數(shù)據(jù)可以看出，該試劑在 60°C 下非常穩(wěn)定。在 20 分鐘的孵育期內(nèi)，空白吸光度值增加了不到 0.01 吸光度單位，測定的活性下降不到 3%（與未預孵育的試劑相比）。
圖 3. 淀粉酶 HR 測定試劑在 60°C 下的溫度穩(wěn)定性。
將試劑的等分試樣在 60°C 下孵育 0-20 分鐘，冷卻至室溫后用于在 40°C 下測定真菌α-淀粉酶。
D. 以淀粉為底物，Ceralpha 單位（CU）與國際單位（IU）的換算
使用淀粉酶 HR 試劑和 ACS 可溶性淀粉（1% w/v；使用 Nelson-Somogyi 還原糖法測定；國際單位）測定了純枯草芽孢桿菌、黑曲霉和大麥麥芽α-淀粉酶的活性，換算因子如下：
黑曲霉（兩種測定均在 pH 5.4 下進行）
以淀粉為底物，IU=0.94×CU
枯草芽孢桿菌（兩種測定均在 pH6.5 下進行)
以淀粉為底物，IU=4.6×CU
大麥麥芽（兩種測定均在 pH 5.4 下進行）
以淀粉為底物，IU=4.1×CU
一個酶活國際單位 （IU） 的定義是：在溫度和 pH 值確定的條件下 ，每分鐘
釋放一微摩爾葡萄糖還原糖當量所需的酶量。
E. Ceralpha 法和 Farrand 法測定小麥和真菌α-淀粉酶的比較。
Farrand 法使用淀粉的β-極限糊精作為底物，通過測量淀粉/碘絡(luò)合物在底物降解時顏色的減少來測定。測定在過量的β-淀粉酶存在下進行，對于谷物樣品，β-淀粉酶來自面粉提取液；對于真菌樣品，需要添加純β-淀粉酶。Farrand 法曾在英國 廣泛使 用， 并使用 Rank Hovis 公司 提供的 β- 極限 糊精。 [Megazyme International 現(xiàn)提供一種純化的β-極限糊精（已去除麥芽糖）。] 在標準 Farrand法中，提取液未緩沖，面粉提取液的 pH 約為 5.8。
在 Campden-Chorleywood 食品研究協(xié)會協(xié)調(diào)的 Farrand 法和 Ceralpha 法的實驗室間比較中，小麥面粉α-淀粉酶的 Farrand 單位與 Ceralpha 單位的相關(guān)性為：
Farrand 單位 = Ceralpha 單位 × 57 - 1.9
一個國際單位（IU）的酶活定義為在特定的溫度和 pH 條件下，每分鐘釋放一微摩爾葡萄糖還原糖當量所需的酶量。
McCleary 和 Sheehan（McCleary and Sheehan，1987）曾報告過類似的相關(guān)性：
Farrand 單位 = Ceralpha 單位 × 57.1
Farrand 單位 = Ceralpha 單位 × 57.1
對于真菌樣品，McCleary 等人得到的回歸方程為：
Farrand 單位 = Ceralpha 單位×69
在添加了真菌α-淀粉酶的小麥面粉中測定α-淀粉酶時，由于兩種組分混合的問題（其中一種組分的酶含量很低，另一種組分的酶含量比第一種組分高數(shù)千倍），可能會出現(xiàn)誤差。為了盡量減少可能由于這兩種組分混合不完全而導致的誤差，應(yīng)進行雙份樣品測定，并提取較大樣品（約 6 g/40 mL）。
F. Ceralpha 法（CU）、ASBC 法（DU）與 AACC 法 22-01（SKB 單位）
測定α-淀粉酶的比較
AACC 法 22-01（SKB 單位）使用一種由 AACC/ASBC 提供的“特殊”林特納淀粉制備的β-極限糊精。該方法通過測量α-淀粉酶在 30°C 下與β-極限糊精孵育時達到特定碘色的時間來測定。
ASBC/EBC/國際法（糊精化單位，DU）使用與 AACC 法 22-01 相同的底物和相同的酶濃度，活性單位的計算方式也相同。然而，由于該測定在 20°C 下進行，因此對于特定麥芽樣品，DU 值大約是同一麥芽樣品 SKB 值的一半。AACC 方法 22-01(SKB 單位)和麥芽粉 Ceralpha 單位(CU)之間的關(guān)系如圖 5 所示。α-淀粉酶(DU)的 ASBC(國際方法)和 Ceralpha 方法(CU)之間的關(guān)系如圖 6 所示。
圖 5. Ceralpha 法和 AACC 法 22-01（SKB）測定麥芽粉中α-淀粉酶的相關(guān)性用兩種方法對 7 份麥芽樣品進行重復分析。
圖 6 Ceralpha 法和 ASBC（國際法）測定麥芽粉中α-淀粉酶的相關(guān)性。用兩種方法對 7 份麥芽樣品進行重復分析。
麥芽、真菌和細菌 a-淀粉酶的 SKB 單位與 Ceralpha 單位的換算系數(shù)如下：
麥芽α-淀粉酶：
SKB 單位=0.42×Ceralpha 單位(CU)-0.34。
（SKB 在 pH 4.7 下進行；Ceralpha 在 pH 5.4 下進行）。
真菌α-淀粉酶：
SKB 單位 = 0.60 x Cera lpha 單位(CU ) 。
(SKB 在 pH 5.4 下進行；Ceralpha 在 pH 5.4 下進行)。
細菌α-淀粉酶：
SKB 單位 = 1.8 x Ceralpha 單位(CU ) 。
（SKB 在 pH 6.5 下進行；Ceralpha p 在 pH 6.5 進行。
G. 谷物、真菌和細菌α-淀粉酶 在不同 pH 值下的活力曲線
使用 Ceralpha 法和淀粉酶 HR 試劑測定了小麥麥芽、大麥麥芽、真菌（黑曲霉）和細菌（枯草芽孢桿菌）α-淀粉酶的 pH 活性曲線。對于谷物和真菌α-淀粉酶，使用蘋果酸和富馬酸緩沖液（100 mM，pH 5.0-6.4）制備 pH 曲線；對于細菌α-淀粉酶，使用富馬酸和 Bis-Tris 丙烷緩沖液（pH 5.6-9.0）。所有緩沖液均含有10 mM 氯化鈣。純化的小麥麥芽和真菌α-淀粉酶的曲線如圖 7 所示。大麥麥芽α-淀粉酶的曲線與小麥麥芽相同�？莶菅挎邨U菌α-淀粉酶的 pH 活性曲線如圖 8所示。
真菌α-淀粉酶使用淀粉酶 HR 試劑和 Ceralpha 試劑（含有淀粉葡萄糖苷酶和酵母α-葡萄糖苷酶）進行測定，兩條曲線相同。
使用 Ceralpha 法和淀粉酶 HR 試劑測定了小麥麥芽、大麥麥芽、真菌（黑曲霉）和細菌（枯草芽孢桿菌）α-淀粉酶的 pH 活性曲線。對于谷物和真菌α-淀粉酶，使用蘋果酸和富馬酸緩沖液（100 mM，pH 5.0-6.4）制備 pH 曲線；對于細菌α-淀粉酶，使用富馬酸和 Bis-Tris 丙烷緩沖液（pH 5.6-9.0）。所有緩沖液均含有10 mM 氯化鈣。純化的小麥麥芽和真菌α-淀粉酶的曲線如圖 7 所示。大麥麥芽α-淀粉酶的曲線與小麥麥芽相同�？莶菅挎邨U菌α-淀粉酶的 pH 活性曲線如圖 8所示。
真菌α-淀粉酶使用淀粉酶 HR 試劑和 Ceralpha 試劑（含有淀粉葡萄糖苷酶和酵母α-葡萄糖苷酶）進行測定，兩條曲線相同。
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