引言
近年來，科學家發(fā)現(xiàn)非編碼RNA（ncRNA）在細胞中扮演著重要角色。ncRNA的失調(diào)與癌癥、神經(jīng)退行性疾病等多種疾病有關(guān)。因此，開發(fā)針對ncRNA的小分子藥物成為藥物研發(fā)的新方向。然而，RNA的結(jié)構(gòu)復雜且多變，這使得它成為藥物靶點的難度較大。傳統(tǒng)的藥物篩選方法在RNA靶點上的應用效果有限，而小分子微陣列（SMM）技術(shù)為RNA靶向藥物的發(fā)現(xiàn)提供了新的可能性。

來自俄亥俄州立大學等單位的研究人員利用小分子微陣列（SMM）技術(shù)，篩選并鑒定了Methanobrevibacter smithii（Msm）RNase P RNA（RPR）的抑制劑。RNase P是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的核酶，負責前體tRNA的5'端成熟。由于它在不同生物中的結(jié)構(gòu)多樣性和低拷貝數(shù)，RNase P成為潛在的藥物靶點。通過SMM篩選，研究人員發(fā)現(xiàn)了多個能夠特異性結(jié)合Msm RPR的小分子，并進一步驗證了其中一種二芳基哌啶類化合物（M1）的抑制活性。

小分子微陣列（SMM）篩選技術(shù)
SMM技術(shù)是一種高通量篩選方法，能夠快速鑒定與目標RNA結(jié)合的小分子。在這項研究中，研究人員使用了Arrayjet公司的Robotic Microarray Printer（Arrayjet, Roslin, UK）來制備微陣列。該設備能夠?qū)?300種化合物精確打印在化學修飾的玻璃片上，形成高密度微陣列。此外，研究人員還使用了InnoScan 1100 AL熒光掃描儀（Innopsys, Carbonne, France）來檢測熒光信號。

具體實驗步驟如下：
微陣列制備：使用Arrayjet公司的Robotic Microarray Printer將7300種化合物打印在載玻璃片上。
RNA標記：Msm RPR通過5'端延伸的DNA寡核苷酸與Cy5熒光標記的DNA寡核苷酸互補結(jié)合，形成熒光標記的Msm RPR。
篩選過程：將熒光標記的Msm RPR與微陣列上的小分子孵育，使用InnoScan 1100 AL掃描儀進行熒光成像，檢測小分子與RNA的結(jié)合情況。
數(shù)據(jù)分析：通過計算每個點的熒光強度，篩選出與Msm RPR特異性結(jié)合的小分子。篩選標準包括信噪比（SNR）大于0、Z-score大于3、重復點的變異系數(shù)（CV）小于100等。
 
InnoScan 1100 AL熒光掃描儀在這項研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。它的高分辨率和靈敏度使得研究人員能夠準確檢測微陣列上每個點的熒光信號，從而篩選出與Msm RPR結(jié)合的小分子。通過該儀器，研究人員在400 mM Mg²⁺條件下篩選出48個與Msm RPR特異性結(jié)合的小分子，命中率為0.7%（圖1C）。在10 mM Mg²⁺條件下，篩選出58個結(jié)合分子，命中率為0.8%。值得注意的是，兩種條件下僅有8個化合物重疊，表明不同Mg²⁺濃度下Msm RPR的構(gòu)象變化影響了小分子的結(jié)合。 （A） 帶有5'和3'延伸的Msm RPR的二級結(jié)構(gòu)（文中稱為Msm RPR）。在該圖中，P表示RPR中按轉(zhuǎn)錄順序標記的配對區(qū)域，L表示環(huán)狀區(qū)域。使用與5'延伸互補的Cy5標記的DNA寡核苷酸生成熒光標記的Msm RPR，用于后續(xù)的SMM篩選�？s寫：PC，陽性對照；NC，陰性對照。
（B） Mg²⁺對Msm RPR前體tRNA加工活性的影響。變性聚丙烯酰胺凝膠[10%（w/v）/7 M尿素]顯示，在10 mM或400 mM Mg²⁺存在下，Msm RPR對5'-[32P]標記的Thermus thermophilus（Tth）前體tRNA⁶ˡʸ的切割情況，反應在37°C下進行1小時。
（C） Z-score散點圖，比較在400 mM或10 mM Mg²⁺條件下的SMM篩選結(jié)果。藍色數(shù)據(jù)點表示在400 mM Mg²⁺條件下優(yōu)先結(jié)合的小分子。紅色虛線對應Z-score值為3，Z-score大于3的小分子被認為是選擇性結(jié)合物。

為了進一步驗證篩選出的小分子與Msm RPR的結(jié)合親和力，研究人員使用了Plexera公司的表面等離子體共振成像（SPRi）技術(shù)。SPRi技術(shù)是一種無標記的光學傳感技術(shù)，能夠?qū)崟r監(jiān)測分子間的相互作用。在這項研究中，研究人員將M1及其類似物固定在SPRi芯片上，通過流動相中的Msm RPR與芯片上的小分子結(jié)合，檢測結(jié)合過程中的折射率變化，從而計算出結(jié)合親和力（K_D(app)）。

具體實驗步驟如下：
芯片制備：使用Plexera公司的SPRi芯片，將M1及其類似物以8×8陣列格式打印在芯片表面。
結(jié)合實驗：將折疊好的Msm RPR注入流動池，進行300秒的結(jié)合和300秒的解離過程，流速為2 μL/s。
數(shù)據(jù)分析：通過Plexera SPR Data Analysis軟件分析結(jié)合曲線，計算出M1及其類似物與Msm RPR的結(jié)合親和力。

通過SPRi技術(shù)，研究人員確定了M1與Msm RPR的結(jié)合親和力（K_D(app)）為8 ± 3 μM（圖3C, D），進一步驗證了M1的抑制活性。 （C） 用于測定M1syn與Msm RPR結(jié)合親和力的代表性表面等離子體共振成像（SPRI）傳感圖。將濃度遞增的Msm RPR（0.625–20 μM）流過M1syn固定的芯片，獲得SPRI傳感圖和相應的結(jié)合曲線（D）三次獨立試驗的數(shù)據(jù)用于計算報告的結(jié)合親和力（K_D(app)）值的平均值和標準偏差。
 
M1的抑制活性驗證
在篩選出的48個結(jié)合分子中，研究人員進一步驗證了M1的抑制活性。M1是一種二芳基哌啶類化合物，具有較好的藥物特性，包括三個芳環(huán)、兩個氫鍵供體、一個氫鍵受體和401 Da的分子量。通過前體tRNA切割實驗，研究人員發(fā)現(xiàn)M1能夠抑制Msm RPR的活性，抑制常數(shù)（Ki）為17 ± 1 μM。此外，SPRi實驗進一步驗證了M1與Msm RPR的結(jié)合親和力（K_D(app)為8 ± 3 μM）。

結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（SAR）分析
為了進一步理解M1的抑制機制，研究人員合成了多個M1類似物，并進行了結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系分析。結(jié)果表明，M1的核心結(jié)構(gòu)中的甲基和哌啶環(huán)上的氮原子對其抑制活性至關(guān)重要。例如，去除甲基（M1-desMe）導致結(jié)合親和力下降4-5倍，抑制活性下降6倍。此外，哌啶環(huán)上的氮原子修飾（如M1-desMe-N-allyl）進一步降低了抑制活性。這些結(jié)果表明，M1的結(jié)構(gòu)特征與其抑制活性密切相關(guān)。

M1的選擇性分析
為了驗證M1的選擇性，研究人員測試了M1及其類似物對另一種結(jié)構(gòu)相似的古菌RNase P RNA（Pfu RPR）的抑制效果。結(jié)果表明，M1及其類似物對Pfu RPR沒有明顯的抑制作用，進一步證明了M1對Msm RPR的選擇性。這一選擇性可能與Msm RPR和Pfu RPR在結(jié)構(gòu)上的細微差異有關(guān)，尤其是Msm RPR的AU含量較高，可能形成了適合M1結(jié)合的構(gòu)象。

討論與展望
這項研究展示了SMM技術(shù)在RNA靶向藥物篩選中的應用潛力。通過SMM篩選，研究人員成功鑒定了Msm RPR的特異性抑制劑M1，并通過結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系分析揭示了其抑制機制。M1的選擇性抑制為開發(fā)針對特定RNA靶點的小分子藥物提供了新的思路。

未來的研究方向包括進一步優(yōu)化M1的結(jié)構(gòu)以提高其抑制活性，并探索其在減少牛瘤胃中甲烷排放中的應用。此外，M1的類似物可能被用于開發(fā)針對人類RNase P RNA（H1 RNA）的抑制劑，H1 RNA的失調(diào)與非小細胞肺癌等多種疾病相關(guān)。通過SMM技術(shù)篩選出的RNA靶向小分子有望為這些疾病的治療提供新的藥物候選物。

文獻鏈接：
Sidharthan, V., et al., Use of a small molecule microarray screen to identify inhibitors of the catalytic RNA subunit of Methanobrevibacter smithii RNase P. Nucleic Acids Res, 2025. 53(1).