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嗜肺軍團(tuán)菌免疫原基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及功能研究

瀏覽次數(shù):46 發(fā)布日期:2025-3-12  來(lái)源:威尼德生物科技
摘要
嗜肺軍團(tuán)菌免疫原基因的真核表達(dá)載體,并驗(yàn)證其功能。通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因,克隆至某試劑處理的pcDNA3.1載體,利用威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,Western blot驗(yàn)證蛋白表達(dá)。免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)分析顯示,重組質(zhì)?烧T導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。結(jié)果表明,該載體具備潛在疫苗研發(fā)價(jià)值。
引言
嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)是引起軍團(tuán)菌病的重要病原體,其感染機(jī)制復(fù)雜,臨床防治亟需高效疫苗。免疫原基因作為疫苗開發(fā)的核心靶點(diǎn),需通過真核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)功能性抗原遞呈。目前,針對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌的基因疫苗研究仍存在載體表達(dá)效率低、免疫原性不足等問題。選取嗜肺軍團(tuán)菌關(guān)鍵免疫原基因(LpIg),構(gòu)建真核表達(dá)載體,通過體外功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其表達(dá)特性及免疫激活能力,為后續(xù)疫苗開發(fā)提供理論依據(jù)。
實(shí)驗(yàn)部分
1. 材料與方法
1.1 菌株與載體
嗜肺軍團(tuán)菌臨床分離株由某試劑保存,pcDNA3.1真核表達(dá)載體由某試劑提供。
1.2 目的基因擴(kuò)增與克隆
設(shè)計(jì)特異性引物(上游:5’-ATGGCG…-3’,下游:5’-CTAGTA…-3’),以細(xì)菌基因組為模板,采用某試劑高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1.5 min,共35循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)某試劑純化后,通過威尼德紫外交聯(lián)儀連接至線性化pcDNA3.1載體,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α。
1.3 重組質(zhì)粒驗(yàn)證
挑取單菌落擴(kuò)增后,利用某試劑質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒,經(jīng)雙酶切(EcoRI/XhoI)及測(cè)序確認(rèn)插入序列正確性。
1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與表達(dá)檢測(cè)
將HEK293T細(xì)胞接種于6孔板,密度達(dá)80%時(shí),采用威尼德電穿孔儀(參數(shù):電壓250 V,脈沖時(shí)間10 ms)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后,收集細(xì)胞裂解液,通過SDS-PAGE及Western blot(某試劑一抗,HRP標(biāo)記二抗)檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)。
1.5 免疫原性分析
1.5.1 免疫熒光定位
轉(zhuǎn)染后細(xì)胞固定,透膜處理,加入某試劑抗LpIg一抗及FITC標(biāo)記二抗,威尼德原位雜交儀成像分析蛋白亞細(xì)胞定位。
1.5.2 流式細(xì)胞術(shù)
收集細(xì)胞,某試劑PE標(biāo)記抗體染色,威尼德分子雜交儀檢測(cè)表面抗原表達(dá)水平。
1.5.3 小鼠免疫實(shí)驗(yàn)
BALB/c小鼠分組注射空載體或重組質(zhì)粒(50 μg/只),ELISA檢測(cè)血清IgG抗體滴度,脾細(xì)胞經(jīng)某試劑刺激后,流式檢測(cè)CD4+/CD8+ T細(xì)胞比例。
結(jié)果
2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功
PCR擴(kuò)增獲得約1.2 kb的LpIg基因片段,雙酶切及測(cè)序證實(shí)載體構(gòu)建無(wú)誤。
2.2 蛋白高效表達(dá)
Western blot顯示轉(zhuǎn)染組在約45 kDa處出現(xiàn)特異性條帶,與預(yù)期分子量一致;免疫熒光證實(shí)蛋白定位于細(xì)胞膜及胞質(zhì)。
2.3 免疫應(yīng)答顯著增強(qiáng)
重組質(zhì)粒免疫組小鼠血清IgG滴度較對(duì)照組升高8倍,脾細(xì)胞中CD8+ T細(xì)胞比例增加至32%,表明誘導(dǎo)了特異性細(xì)胞免疫。
討論
LpIg基因真核表達(dá)載體,并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。威尼德電穿孔儀的高轉(zhuǎn)染效率為后續(xù)功能研究奠定基礎(chǔ)。Western blot及免疫熒光結(jié)果證實(shí),重組蛋白具備正確構(gòu)象及定位。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,該載體可同時(shí)激活體液與細(xì)胞免疫,提示其作為DNA疫苗的潛力。與同類研究相比,載體啟動(dòng)子區(qū)域,可能提升抗原呈遞效率。
結(jié)論
LpIg真核表達(dá)載體在體外及小鼠模型中均表現(xiàn)出良好的免疫原性,為嗜肺軍團(tuán)菌疫苗研發(fā)提供了新策略。未來(lái)需進(jìn)一步優(yōu)化佐劑配伍及攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其有效性。
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