本文要點(diǎn)：本研究設(shè)計(jì)并合成了一種新型NIR-II有機(jī)小分子CTB1125。得益于高供體-受體-供體（D-A-D）結(jié)構(gòu)促進(jìn)的高效分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT），CTB1125的最大發(fā)射波長(zhǎng)為1125 nm。此外，通過(guò)在共軛稠環(huán)骨架上修飾支鏈烷基鏈，減少了分子間堆積。CTB1125被封裝于兩親性共聚物PS2000-PEG2000中形成CTB1125-NPs，其在水溶液中表現(xiàn)出高達(dá)4.84%的熒光量子產(chǎn)率、優(yōu)異的光穩(wěn)定性及高信噪比。憑借這些卓越性能，CTB1125-NPs已成功用于清晰且持久的NIR-II血管成像（使用少量CTB1125-NPs、低激光功率和短曝光時(shí)間），并通過(guò)熒光成像精確引導(dǎo)小鼠腫瘤的手術(shù)切除。這項(xiàng)工作為深部組織成像和圖像引導(dǎo)手術(shù)提供了一種具有超高亮度的NIR-II熒光團(tuán)。

方案1. NIR-II納米熒光團(tuán)用于血管成像及熒光圖像引導(dǎo)腫瘤切除手術(shù)的示意圖

本文設(shè)計(jì)并合成了一種新型D-A-D型NIR-II有機(jī)小分子熒光團(tuán)CTB1125（方案1）。選擇具有大自共軛的富電子雜環(huán)環(huán)戊二烯并[2,1-b:3,4-b']二噻吩（CPDT）作為供體單元。受體部分為具有穩(wěn)定醌式結(jié)構(gòu)的苯并[1,2-c:4,5-c']雙([1,2,5]噻二唑)（BBTD）。該結(jié)構(gòu)的最大發(fā)射波長(zhǎng)達(dá)到1125 nm，其在有機(jī)溶劑中的熒光量子產(chǎn)率高達(dá)10.2%。這是目前已報(bào)道的發(fā)射波長(zhǎng)超過(guò)1100 nm的熒光團(tuán)中量子產(chǎn)率最高者。此外，通過(guò)CTB1125與PS2000-PEG2000自組裝構(gòu)建了CTB1125-NPs納米顆粒。憑借平衡的發(fā)射波長(zhǎng)和4.84%的水溶液量子產(chǎn)率，CTB1125-NPs可用于低劑量（200 μL，50 μM）、低激光功率（0.3 W cm⁻²）和短曝光時(shí)間（50 ms）的NIR-II成像。成功實(shí)現(xiàn)了小鼠血管的高分辨率NIR-II熒光成像及圖像引導(dǎo)的腫瘤手術(shù)切除。

圖1. CTB1125的合成路線和表征

如圖1b所示，CTB1125在600-1000 nm范圍內(nèi)具有寬吸收峰（峰值約895 nm）。在895 nm激光激發(fā)下，其在己烷中的發(fā)射光譜覆蓋900-1400 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為1125 nm。如圖1c所示，最高占據(jù)分子軌道（HOMO）主要分布于整個(gè)共軛骨架上，顯示出優(yōu)異的分子共軛效應(yīng)。而最低未占分子軌道（LUMO）幾乎不包含供體貢獻(xiàn)，主要集中于受體和π橋單元。根據(jù)計(jì)算結(jié)果，能隙為1.14 eV。CTB1125的大共軛結(jié)構(gòu)有助于形成窄帶隙，從而在近紅外區(qū)域產(chǎn)生強(qiáng)吸收。

如圖1d-f所示，以ICG（量子產(chǎn)率QY：DMSO中14%）為參比，CTB1125在己烷中的量子產(chǎn)率達(dá)10.2%；以IR-1061（QY：DCM中1.7%）為參比時(shí)，QY為8.15%。CTB1125優(yōu)異的發(fā)射波長(zhǎng)和超高量子產(chǎn)率表明其在NIR-II成像中具有廣闊應(yīng)用前景。為研究不同極性溶劑中的光學(xué)性質(zhì)，測(cè)定了CTB1125在不同溶劑中的吸收和熒光光譜。

圖2. CTB1125-NPs制備流程和熒光成像

為實(shí)現(xiàn)生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，選擇兩親性PS2000-PEG2000聚合物通過(guò)納米共沉淀法負(fù)載CTB1125，構(gòu)建具有高亮度和良好生物相容性的水分散CTB1125-NPs納米探針（圖2a）。CTB1125-NPs的吸收光譜（600-1000 nm）和發(fā)射光譜（900-1400 nm）與CTB1125相似（圖2b）。水合粒徑表征和透射電鏡（TEM）圖像顯示，CTB1125-NPs呈均勻球形，平均尺寸約22 nm（圖2c）。如圖2d,e所示，以PS2000-PEG2000制備的CTB1125-NPs亮度顯著高于其他兩親性基質(zhì)制備的納米顆粒。所得CTB1125-NPs的量子產(chǎn)率約為4.84%（以ICG為參比；若以IR1061為參比則為3.87%），較CTB1125直接分散于水中的樣品熒光增強(qiáng)約23倍。該量子產(chǎn)率遠(yuǎn)高于當(dāng)前研究中發(fā)射波長(zhǎng)超過(guò)1100 nm的NIR-II染料。此外，CTB1125-NPs在水中的808 nm消光系數(shù)達(dá)3.44×10⁴ M⁻¹cm⁻¹，確保了NIR-II成像期間的信號(hào)亮度。因此，CTB1125-NPs的高亮度使其能夠在低劑量下實(shí)現(xiàn)高靈敏度成像。

進(jìn)一步研究了CTB1125-NPs的光穩(wěn)定性并與ICG對(duì)比。在808 nm激光照射30分鐘后，DMSO中的ICG迅速光漂白，幾乎無(wú)熒光；而CTB1125-NPs的吸收和熒光光譜變化可忽略，溶液仍保持高亮度（圖2f-i）。CTB1125-NPs的生物相容性通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)估。當(dāng)用1-100 μM濃度的CTB1125-NPs處理HUVEC、HepG2和H22細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞存活率均高于88%（圖2j）。以上結(jié)果證明CTB1125-NPs具有長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)、超高量子產(chǎn)率、優(yōu)異穩(wěn)定性和生物相容性，適用于NIR-II成像。

圖3. CTB1125-NPs與ICG體外穿透深度評(píng)估實(shí)驗(yàn)

如圖3a所示，使用雞胸肉模擬組織，根據(jù)信號(hào)背景比（SBR）和半峰全寬（FWHM）評(píng)估CTB1125 NPs的穿透能力。在相同濃度（20µM）條件下，將H2O中的CTB1125 NPs和DMSO中的ICG都灌注到毛細(xì)管中。如圖3b所示，沒(méi)有覆蓋雞組織時(shí)，由于ICG在DMSO中的QY高于CTB1125 NPs在水中的QY，ICG顯示出比CTB1125 NPs更亮的熒光和更清晰的成像邊界。然而，當(dāng)覆蓋1毫米的雞組織時(shí)，ICG顯示出熒光亮度的急劇衰減，這是由于ICG在1000納米以上的較長(zhǎng)波長(zhǎng)處發(fā)射較弱造成的。相比之下，即使覆蓋7mm的雞組織，CTB1125 NPs仍然可以觀察到明顯的NIR-II發(fā)射。CTB1125 NPs和ICG橫截面的熒光強(qiáng)度和相應(yīng)的Guass擬合曲線也在圖3c中進(jìn)行了定量。當(dāng)組織厚度小于3mm時(shí)，CTB1125 NPs的FWHM沒(méi)有顯著增加。由于其長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)，在7mm的組織厚度內(nèi)保持大于2的SBR。相比之下，ICG的FWHM隨著組織厚度的增加而顯著增加，SBR急劇下降（圖3d，e）。所有這些結(jié)果表明，CTB1125 NPs在低濃度下實(shí)現(xiàn)了更高的組織穿透深度和成像SBR，從而實(shí)現(xiàn)了理想的體內(nèi)NIR-II熒光探針。

如圖4a所示，半小時(shí)內(nèi)，CTB1125 NPs通過(guò)血液集中在小鼠的肺部，并在肝臟中部分富集。然后，大量的CTB1125 NPs被腸道吸收，在≈4小時(shí)內(nèi)到達(dá)結(jié)腸，隨后被排泄系統(tǒng)代謝。6小時(shí)后，剩余的CTB1125 NPs在肝臟中逐漸富集，并在8小時(shí)達(dá)到峰值。隨后，CTB1125 NPs逐漸被肝臟清除和代謝。特別是，在12小時(shí)內(nèi)可以清楚地觀察到小鼠的血管。

為了進(jìn)一步研究其藥代動(dòng)力學(xué)，在不同時(shí)間收集注射CTB1125 NPs的BALB/c小鼠的血液，并對(duì)血液進(jìn)行NIR-II成像。如圖4b、c所示，血液中CTB1125 NP的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間而降低。靜脈注射后12小時(shí)，血液中CTB1125 NP的強(qiáng)度仍保持在初始值的一半，這表明CTB1125 NPs的血液循環(huán)時(shí)間較長(zhǎng)。因此，它適用于長(zhǎng)期血管成像，而無(wú)需額外補(bǔ)充成像劑，從而減輕代謝負(fù)擔(dān)。在NIR-II成像系統(tǒng)下獲得的體外器官圖像顯示，CTB1125 NPs主要積聚在肝臟中（圖4d，e）。最后，評(píng)估了CTB1125 NPs在小鼠體內(nèi)的生物安全性。由于血液循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)、低毒性和高亮度的優(yōu)點(diǎn)，用少量CTB1125 NPs、低激光功率和短曝光時(shí)間實(shí)現(xiàn)清晰、長(zhǎng)時(shí)間的NIR-II血管成像是有前景的。

圖5. CTB1125-NPs靜脈注射后，BALB/c裸鼠右后肢（a,e）、左后肢（b）、腹部（c,f）及腦部（d,g）的NIR-II圖像

為了評(píng)估CTB1125 NPs在體內(nèi)成像的空間分辨率能力，用DMSO中的ICG溶液作為對(duì)照對(duì)BALB/c裸鼠的腹部和后肢進(jìn)行成像。使用1150 nm帶通濾光片的NIR-II成像顯示，在1.49到2.52之間的SBR比使用1000 nm長(zhǎng)通濾光片的SBR高得多（圖5a-d）。與此同時(shí)，BP 1150濾光片只允許1125-1175 nm范圍內(nèi)的光通過(guò)。因此，來(lái)自背景的短波長(zhǎng)熒光信號(hào)被大大過(guò)濾。即使在較長(zhǎng)的曝光時(shí)間下，CTB1125 NPs的熒光信號(hào)也可以很好地與背景信號(hào)區(qū)分開。此外，半峰全寬（FWHM）也用于評(píng)估不同濾光片下CTB1125 NPs的成像分辨率（圖5e-g）。當(dāng)量化同一位置的成像熒光強(qiáng)度時(shí)，信號(hào)的高斯擬合曲線表明，使用1150nm帶通濾波器可以獲得更窄的FWHM。值得注意的是，由于顱骨皮膚組織較厚，使用BP 1150濾波器對(duì)腦血管進(jìn)行成像時(shí)，F(xiàn)WHM可以從639.6µm顯著降低到354.8µm，從而顯著提高了成像質(zhì)量。所有結(jié)果表明，在0.3 W cm−2的低功率激光輻射和不超過(guò)150 ms的曝光時(shí)間下，僅注射200µL 50µM CTB1125 NPs即可獲得高清晰度和分辨率的圖像。

圖6. CTB1125-NPs靜脈注射后不同時(shí)間點(diǎn)荷瘤小鼠背部的NIR-II圖像及48小時(shí)后NIR-II熒光引導(dǎo)的H22腫瘤切除術(shù)

為了評(píng)估CTB1125 NP的腫瘤成像能力，通過(guò)尾靜脈向H22荷瘤小鼠注射CTB1125 NPs，然后在不同時(shí)間對(duì)腫瘤進(jìn)行NIR-II成像。如圖6a所示，由于增強(qiáng)的滲透性和保留性（EPR）效應(yīng)，隨著時(shí)間的推移，越來(lái)越多的CTB1125 NPs在腫瘤部位富集，導(dǎo)致腫瘤亮度增加，達(dá)到約48小時(shí)的峰值（圖6b）。NIR-II熒光成像下腫瘤的輪廓通常與可見光下的形狀一致（圖6c）。在注射CTB1125 NPs后96小時(shí)，解剖攜帶H22腫瘤的小鼠，并對(duì)其器官和腫瘤進(jìn)行成像。CTB1125 NPs的小尺寸使其更傾向于通過(guò)EPR效應(yīng)在腫瘤中積聚。觀察到腫瘤區(qū)域和肝臟顯示出強(qiáng)烈的熒光（圖6d，e），表明CTB1125 NPs可以在腫瘤部位很好地富集，并在靜脈注射后被肝臟部分代謝。借助強(qiáng)NIR-II熒光信號(hào)，在成像的指導(dǎo)下手術(shù)切除腫瘤組織。如圖6f所示，腫瘤和正常組織之間的邊界是明顯的。在量化腫瘤部位和正常組織的熒光信號(hào)后，手術(shù)切除前后腫瘤部位的T/N比分別為3.05±0.10和1.08±0.16。這表明在手術(shù)切除之前，腫瘤部位可以很好地與正常組織區(qū)分開來(lái)。因?yàn)槟[瘤的邊緣可以足夠清晰地成像，所以手術(shù)可以足夠精確地完全切除腫瘤。最終，術(shù)后組織具有與正常組織基本相同的熒光信號(hào)。如圖6g所示，切除的具有強(qiáng)熒光信號(hào)的組織是腫瘤組織。腫瘤組織周圍殘留的上皮組織（圖6h）、肌肉組織（圖6i）和紅細(xì)胞（圖6j）較少。

總之，研究者設(shè)計(jì)并合成了一種新型D-A-D型NIR-II熒光探針CTB1125，其平衡了發(fā)射波長(zhǎng)與量子產(chǎn)率。通過(guò)選擇合適的供體和受體單元，將能隙大幅降低至1.14 eV，獲得了從NIR-I至NIR-IIa的寬發(fā)射光譜（最大波長(zhǎng)1125 nm）。通過(guò)修飾支鏈烷基減少分子間堆積，使其在有機(jī)溶劑中的量子產(chǎn)率高達(dá)10.2%。進(jìn)一步通過(guò)PS-PEG封裝形成CTB1125-NPs，有效抑制了水環(huán)境中TICT效應(yīng)引起的熒光猝滅，最終獲得量子產(chǎn)率4.84%的納米熒光材料。與商用染料ICG相比，CTB1125-NPs具有更長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)、更優(yōu)光穩(wěn)定性及更高成像信噪比。憑借這些優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)了小鼠血管成像及NIR-II熒光引導(dǎo)的腫瘤手術(shù)切除。
 

參考文獻(xiàn)

Zhang X, Li L, Ren Y, et al. Organic NIR‐II Nanofluorophore with Ultrahigh Quantum Yield for Vessels Imaging and Fluorescence Image‐Guided Surgery[J]. Advanced Functional Materials, 2025, 35(3): 2413341.

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