一、 慢病毒實驗步驟

慢病毒的實驗流程大致分為：質(zhì)粒構(gòu)建—病毒包裝—病毒收集與濃縮—感染靶細胞—篩選與驗證

1、質(zhì)粒構(gòu)建

構(gòu)建重組質(zhì)粒，將外源目的基因片段插入質(zhì)粒載體，得到重組質(zhì)粒，在大腸桿菌內(nèi)轉(zhuǎn)化，并抽提得到重組質(zhì)粒DNA。

2、病毒包裝

將重組質(zhì)粒DNA和其他包裝質(zhì)粒按照說明書的一定比例一起共轉(zhuǎn)染293T細胞，48小時、72小時分別收獲含病毒的上清。

3、病毒收集濃縮

收集的含病毒上清3000 rpm 離心20min，0.45um濾膜過濾，去除細胞沉淀。將上清繼續(xù)12000轉(zhuǎn)離心初步濃縮、分裝-80°C貯存。必要時滴度測定目的基因檢定。超速離心法及PEG沉淀法均可有效濃縮病毒，但前者設(shè)備要求高；后者雖操作簡便，成本低，但效率稍低。

4、慢病毒轉(zhuǎn)染細胞

第一天：細胞接種

以293T細胞為例，將狀態(tài)良好的目的細胞消化收集，通過細胞計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞密度至1x10⁵個/mL，接種到24孔板，每孔加0.5mL，混勻后放37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。由于不同細胞的生長速度不同，細胞接種量也會有所不同。一般保證接種的第二天進行感染時細胞匯合度在30%-50%即可。 

第二天：加病毒轉(zhuǎn)染

觀察293T細胞生長情況，吸去24孔板內(nèi)細胞中的舊培養(yǎng)基，加入提前預(yù)熱的新鮮完全培養(yǎng)液，每孔0.25mL，放37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時。注意動作輕柔，以免吸走細胞或者將細胞吹起漂浮。4小時后每孔補加0.25mL新鮮完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。注意：部分孔不加病毒，作為對照組。

第三天：全量換液

轉(zhuǎn)染后第二天，也就是加病毒24小時，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)是否有異常，并記錄，無異常的情況下吸去24孔板內(nèi)含有病毒的培養(yǎng)液，補加新鮮的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

第四-六天：觀察轉(zhuǎn)染效果

若轉(zhuǎn)染了帶熒光基團的慢病毒，可以在轉(zhuǎn)染后48小時通過倒置熒光顯微鏡檢測其熒光強度從而初步檢測轉(zhuǎn)染效果。也可以在此時加入適宜濃度的puromycin或其他篩選藥物篩選出成功轉(zhuǎn)染的細胞。注意：對于生長緩慢的細胞，可以延長觀察時間至96小時。

二、慢病毒實驗注意事項

（1）病毒的保存適當：病毒短期可存放4℃冰箱保持（不超過一周），長期保存需分裝后-80℃冰箱存放不超過6個月，使用時冰上融化，避免反復(fù)凍融而影響病毒活性。超過6個月，病毒滴度有可能降低。

（2）細胞狀態(tài)：選擇生長對數(shù)期的細胞進行轉(zhuǎn)染，細胞活性好，有利于提高細胞轉(zhuǎn)染效率。

（3）細胞接種量：根據(jù)細胞的增殖速度和接種的培養(yǎng)器皿決定，細胞接種密度需要適宜，傳代周期在2-3天的，轉(zhuǎn)染前密度在30%-50%。生長緩慢的細胞系或者原代細胞，轉(zhuǎn)染前密度約在90%左右。

（4）MOI值：通常MOI值越高，細胞越難轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前細胞需要計數(shù)，計算細胞接種量。加入病毒的體積(uL)=MOI值X細胞接種量/病毒滴度（Tu/mL）X1000。

（5）實驗前需要查找文獻資料，需要靶細胞的培養(yǎng)條件、生長速度、生長形態(tài)、MOI值、宿主細胞篩選藥物致死濃度等參數(shù)，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。

（6）細胞轉(zhuǎn)染前后，需要觀察細胞狀態(tài)，轉(zhuǎn)染后，若細胞狀態(tài)不佳，可以先不加藥篩選，調(diào)整細胞狀態(tài)，帶狀態(tài)好轉(zhuǎn)后再篩選。若轉(zhuǎn)染48小時后，細胞密度較大，可傳代后待細胞貼壁或穩(wěn)定后加藥篩選處理。

（7）轉(zhuǎn)染效率的觀察時間，一般是轉(zhuǎn)染48小時-72小時觀察，對于有些增殖緩慢的細胞，可以延長觀察時間至96小時甚至更長。

三、實驗常見問題

Q1如何提高慢病毒對細胞的感染效率?

轉(zhuǎn)染過程中，多種因素會影響慢病毒對細胞的感染效率，如細胞自身生長狀態(tài)、細胞接種數(shù)量、細胞被慢病毒感染的難易程度(MOI)等，因此保證細胞狀態(tài)良好，細胞密度適中感染條件適宜，可以達到更好的感染效率。對于懸浮細胞，可采用離心感染的方法，將細胞吹打吸入離心管中,進行低速離心，去掉大部分上清,然后加入適量的病毒液,室溫放置15 min(盡量不要超過30 min),然后將細胞和病毒液同時吸出轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中繼續(xù)病毒感染過夜即可。

Q2轉(zhuǎn)染后細胞死亡，怎么辦？

轉(zhuǎn)染過程中，多種因素會影響慢病毒對細胞的感染效率，如細胞自身生長狀態(tài)、細胞接種數(shù)量、細胞被慢病毒感染的難易程度(MOI)等，因此保證細胞狀態(tài)良好，細胞密度適中感染條件適宜，可以達到更好的感染效率。對于懸浮細胞，可采用離心感染的方法，將細胞吹打吸入離心管中,進行低速離心，去掉大部分上清,然后加入適量的病毒液,室溫放置15 min(盡量不要超過30 min),然后將細胞和病毒液同時吸出轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中繼續(xù)病毒感染過夜即可。

Q3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因會整合到染色體，瞬時轉(zhuǎn)染不會嗎？

不論是瞬轉(zhuǎn)還是穩(wěn)轉(zhuǎn)，DNA都會入核并有一定概率隨機整合到宿主染色體；唯一的區(qū)別在于，穩(wěn)轉(zhuǎn)所用的質(zhì)粒含有抗性基因，后期可以通過藥物篩選，把沒有轉(zhuǎn)進目的基因的細胞殺死，篩選出成功轉(zhuǎn)入目的基因的細胞，并可以傳代遺傳。而瞬時轉(zhuǎn)染由于沒有藥物加壓篩選，加上僅有少量的細胞中有目的基因整合到染色體，所以傳代后，陽性細胞會越來越少，導致目的基因表達量逐漸降低，進而不能長期穩(wěn)定表達。

Q4慢病毒轉(zhuǎn)染時，細胞接種量是多少？

根據(jù)細胞增殖的速度以及接種培養(yǎng)容器大小來調(diào)整細胞接種量，以保證在感染后4天左右細胞剛好快長滿培養(yǎng)皿底部為宜。對大部分細胞系傳代周期在2~3天，感染前細胞鋪板的密度保持在20%~30%左右；對于某些原代細胞，可以在接種時提高匯合度到50%~60%；對于終末分裂細胞，如神經(jīng)元細胞，心肌細胞等，可以按照90%的匯合度進行接種

尚恩生物對常用的細胞系，原代細胞進行慢病毒轉(zhuǎn)染，包括細胞慢病毒轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白（GFP）或者紅色熒光蛋白（mCherry、RFP）、細胞慢病毒轉(zhuǎn)染化學發(fā)光LUC、細胞慢病毒SV40永生化轉(zhuǎn)染，總共近40種穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。也可以進行指定細胞的慢病毒轉(zhuǎn)染。