本文要點：近紅外II區(qū)（NIR-II，900–1880 nm）熒光共聚焦顯微鏡具有高空間分辨率和廣泛的活體成像能力。然而，傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡需要精確的針孔定位，由于針孔尺寸微小且NIR-II熒光不可見，這帶來了挑戰(zhàn)。為簡化系統(tǒng)，本研究采用光纖波長分割多路復(fù)用器（WDM）替代傳統(tǒng)的二向色鏡和針孔，用于激發(fā)光和熒光光束的耦合，使NIR-IIb（1500–1700 nm）熒光與激發(fā)光通過同一根光纖傳輸。這一簡化系統(tǒng)通過光纖無縫集成了關(guān)鍵組件——激發(fā)光源、探測器和掃描顯微裝置。與傳統(tǒng)NIR-II共聚焦系統(tǒng)相比，光纖WDM配置更簡潔且易于調(diào)節(jié)。值得注意的是，該系統(tǒng)成功實現(xiàn)了小鼠腦血管的斷層成像，深度達1000 μm，并能在800 μm深度區(qū)分直徑4.57 μm的微小血管（信背比SBR=5.34）。此外，系統(tǒng)還能清晰成像通常難以觀測的肝臟血管，深度達300 μm。

圖1. 基于WDM的簡化NIR-IIb熒光共聚焦顯微系統(tǒng)

圖1a展示了基于光纖WDM的簡化共聚焦顯微系統(tǒng)。980 nm激光通過WDM的藍端口輸入，經(jīng)反射準(zhǔn)直器輸出準(zhǔn)直光，通過振鏡掃描系統(tǒng)聚焦于樣品。1550 nm熒光反向傳輸至WDM公共端口，經(jīng)四級級聯(lián)WDM濾除激發(fā)光后，由SNSPD檢測（圖1b-e）。光纖核心（9 μm）和準(zhǔn)直器協(xié)同替代針孔，簡化了系統(tǒng)調(diào)節(jié)，并保留了傳統(tǒng)共聚焦的光學(xué)斷層能力。

圖2. 量子點PbS/CdS QDs的表征

選用PbS/CdS量子點作為熒光探針，其熒光發(fā)射峰位于1601 nm（圖2c），滿足WDM的980/1550 nm波段需求。透射電鏡（TEM）顯示量子點尺寸均勻<10 nm，動態(tài)光散射（DLS）表明PEG修飾后水合粒徑為32.7 nm（圖2b）。量子點在高激發(fā)功率下表現(xiàn)出強熒光（圖2d-e），且生物相容性良好。

圖3. 體內(nèi)宏觀成像和顯微成像

為了驗證使用980 nm激發(fā)光在NIR IIb波段內(nèi)PbS/CdS量子點的有效體內(nèi)成像能力，首先在尾靜脈注射200µL 1 mg mL-1量子點后，對小鼠的整個身體和腿部進行宏觀成像（圖3a，b）。功率密度為20mW/cm2，積分時間為150ms，SBR為2.4，可以清楚地區(qū)分腿部的小血管。

隨后，利用PbS/CdS量子點對小鼠腦血管系統(tǒng)進行寬視場顯微成像。首先，對小鼠進行開顱手術(shù)，小心地切除腦膜，然后用一塊圓形玻璃密封顱窗。在尾靜脈注射200µL 6 mg mL-1 QDs后，在NIR IIb波段內(nèi)對小鼠腦血管進行廣角顯微成像，在腦表面使用35 mW的功率和100 ms的積分時間。廣角顯微成像（圖3c1-c8）沒有針孔，缺乏光學(xué)切片能力。在深層組織成像中，表層的熒光充當(dāng)深層的背景，導(dǎo)致背景強度升高，隨后SBR降低。實現(xiàn)的最大成像深度為700µm，在這個深度，SBR的測量值僅為1.12（圖3d）。

圖4. 不同深度腦血管的NIR IIb共聚焦顯微圖像和三維重建

在取出顱骨和腦膜，并用玻璃密封顱窗后，將200µL 6 mg mL-1的QDs注射到尾靜脈中。采用每像素10µs的掃描速度，利用4µm步進移動物鏡進行軸向掃描，對小鼠大腦的單層深度進行掃描。掃描區(qū)域設(shè)置為512×512像素。在之前報道的與NIR-II共聚焦成像相關(guān)的工作中，掃描速度通常需要每像素至少10µs，有些甚至需要每像素≈190µs。此外，大腦表面的激發(fā)功率需要至少為10mW甚至更高。在這項研究中，盡管WDM的帶寬很窄（≈70 nm），導(dǎo)致僅收集了≈28.9%的熒光，并且由于直徑為9µm的針孔，熒光收集效率進一步降低，但憑借高亮度的PbS/CdS量子點和高效的SNSPD，該系統(tǒng)仍然能夠以相對較快的成像速度（每像素10µs）和較低的腦表面功率（僅6 mW）對1000µm以上的小鼠腦血管進行高質(zhì)量的共聚焦顯微成像。值得注意的是，共聚焦顯微鏡的整體背景強度仍然很低，700µm的SBR為39.81，1000µm為5.34，超過了廣角顯微鏡的性能。此外，該成像系統(tǒng)具有高空間分辨率，成功區(qū)分了直徑為4.97µm的小血管，深度為350µm，直徑為4.57µm，深度為800µm（圖4b，c）。由于針孔直徑極�。�9µm），對離焦區(qū)域產(chǎn)生的熒光有更好的過濾效果，從而降低了背景信號。與之前報道的作品相比，這導(dǎo)致了更高的SBR和更好的成像質(zhì)量。使用來自不同深度的圖像，重建了小鼠腦血管的三維（3D）結(jié)構(gòu)（圖4d）。

圖5. 不同深度肝臟的NIR IIb共聚焦顯微圖像

肝血管成像在區(qū)分以血供豐富和血流減少為特征的占位性病變以及診斷肝血管瘤等特定肝臟疾病方面具有寶貴的診斷潛力。然而，由于肝臟組織的結(jié)構(gòu)比大腦更密集，散射系數(shù)更大，肝臟的成像深度往往受到限制。在目前報道的多光子熒光成像相關(guān)研究中，肝臟致密結(jié)構(gòu)的最大可實現(xiàn)成像深度可達250µm。在這項研究中，應(yīng)用NIR IIb共聚焦顯微鏡來觀察小鼠的肝血管。在尾靜脈注射200µL 6 mg mL−1 PbS/CdS量子點，兩小時后，小心切開小鼠腹部，輕輕抬高肝臟并將其放置在載玻片上，蓋上蓋玻片以創(chuàng)建一個專門的成像窗口。肝血管成像（圖5）是在與腦血管成像相同的激發(fā)功率和掃描速度下進行的。掃描區(qū)域設(shè)置為1024×1024像素。值得注意的是，這種方法成功地捕獲了肝組織內(nèi)300µm深度的血管，使SBR保持在2.8。在肝臟血管成像方面，該系統(tǒng)所達到的深度可以與多光子熒光成像系統(tǒng)相媲美。

本工作的新穎之處在于利用帶寬窄、芯徑小的光纖WDM來取代傳統(tǒng)共焦系統(tǒng)中常見的二向色鏡和針孔。這使得共焦系統(tǒng)中的光源、掃描顯微鏡和探測器可以通過光纖輕松連接，從而使整體系統(tǒng)結(jié)構(gòu)更簡單，調(diào)整更容易�；�于WDM的簡化共焦系統(tǒng)表現(xiàn)出改進的長期穩(wěn)定性和再現(xiàn)性。

然而，窄帶寬和小芯直徑雖然有利于系統(tǒng)簡化，但也對熒光探針的選擇施加了一定的限制。由于商用光纖WDM的波長選擇性和帶寬有限，目前需要使用具有寬激發(fā)光譜和高亮度的量子點作為熒光探針。

為了克服這一局限性，未來的工作可能涉及設(shè)計適合特定熒光探針或成像場景的片上WDM器件。一方面，有機熒光探針具有更高的生物相容性，但它們通常具有較小的斯托克斯位移。因此，片上WDM器件可以設(shè)計為與材料的吸收和發(fā)射特性相匹配。通過設(shè)計具有更大熒光透射帶寬的設(shè)備，可以更有效地利用熒光。另一方面，可以探索光學(xué)顯微成像的極限。較長波長的激發(fā)光在組織中的散射系數(shù)較低，能夠有效地聚焦于更大的深度，并為深層組織成像提供優(yōu)勢。此外，在NIR IIx（1400-1500 nm）和NIR-III（2080-2340 nm）波段適當(dāng)增加吸水率可以有效地耗盡散射的熒光光子，從而增強圖像SBR。量子點具有寬激發(fā)光譜和可調(diào)熒光發(fā)射波長，特別適合探索共聚焦顯微鏡中的各種NIR成像窗口。未來，通過設(shè)計合適的片上WDM器件，簡化的近紅外共聚焦顯微系統(tǒng)可以適應(yīng)更廣泛的熒光探針和應(yīng)用場景。
 

本文成功設(shè)計了一個NIR-IIb熒光共聚焦顯微系統(tǒng)，該系統(tǒng)結(jié)合了光纖WDM設(shè)備。該系統(tǒng)具有一系列優(yōu)點，包括設(shè)計簡單、易于調(diào)整和出色的成像深度。它因其對生物組織結(jié)構(gòu)進行高度特異、清晰和細致成像的能力而脫穎而出。預(yù)計這項技術(shù)將在未來的生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

參考文獻

Mou X, Wu T, Zhao Y, et al. From Optical Fiber Communications to Bioimaging: Wavelength Division Multiplexing Technology for Simplified in vivo Large‐depth NIR‐IIb Fluorescence Confocal Microscopy[J]. Small Methods, 2024: 2401426.

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