磷酸化蛋白作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)控者，其研究對(duì)揭示生命奧秘和疾病機(jī)制至關(guān)重要。然而，磷酸化蛋白的低豐度和動(dòng)態(tài)變化特性，WB顯影成像時(shí)常常會(huì)碰到以下問(wèn)題：

• 條帶微弱
• 無(wú)條帶
• 高背景、雜帶多等 

本文整理了磷酸化蛋白Western Blot 實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化建議，以幫助研究人員提升實(shí)驗(yàn)成功率。 

什么是磷酸化蛋白？
磷酸化蛋白是指蛋白質(zhì)在激酶催化下發(fā)生磷酸化修飾的一類(lèi)蛋白質(zhì)。這種修飾如同一個(gè)“開(kāi)關(guān)”，調(diào)控著蛋白質(zhì)的活性、定位和相互作用，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、分化、代謝等幾乎所有生命活動(dòng)。

磷酸化蛋白的研究意義？
磷酸化蛋白的研究廣泛，涉及以下領(lǐng)域：
* 細(xì)胞信號(hào)通路：研究細(xì)胞如何通過(guò)磷酸化響應(yīng)外界刺激。
* 疾病機(jī)制：磷酸化異常與多種疾病相關(guān)，如癌癥、神經(jīng)退行性疾病和糖尿病。
* 藥物開(kāi)發(fā)：磷酸化蛋白是重要的藥物靶點(diǎn)，研究其調(diào)控機(jī)制有助于開(kāi)發(fā)新藥。

如何做好磷酸化蛋白WB檢測(cè)？
為了提升Western Blot檢測(cè)磷酸化蛋白的成功率，我們建議從以下幾方面著手優(yōu)化：

1、通過(guò)有效的樣本制備提高目的蛋白豐度
制備優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)樣品是WB 實(shí)驗(yàn)的起點(diǎn)，特別是針對(duì)低豐度蛋白如磷酸化蛋白、膜蛋白、核蛋白等，建議根據(jù)蛋白定位，使用特定的蛋白提取方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行富集。選擇錯(cuò)誤的裂解液會(huì)造成樣品中無(wú)目的蛋白的情況，例如目的蛋白為核蛋白時(shí)請(qǐng)勿使用NP-40這類(lèi)溫和的裂解液。

2、有效分離蛋白樣品，提高蛋白轉(zhuǎn)印到膜上的效率
為了避免蛋白電泳過(guò)程中被降解，選擇合適的膠和電泳緩沖液非常重要。中性pH加上溫和的樣本制備方案，可以讓蛋白樣品始終處于溫和的非酸性條件下，從而保留了完整性并最大程度地減少了蛋白修飾，所以更適用于低豐度蛋白的分離。

經(jīng)電泳分離的蛋白需要轉(zhuǎn)印到膜材質(zhì)表面，以便后續(xù)抗體能與目的蛋白結(jié)合、檢測(cè)。轉(zhuǎn)印膜要求柔韌易裁剪，耐化學(xué)試劑處理，當(dāng)然最重要的是蛋白載量高，以盡可能提高低豐度蛋白的檢測(cè)成功率。相對(duì)于NC膜，PVDF膜性能優(yōu)越，是公認(rèn)的WB專(zhuān)用膜。膜上沒(méi)有蛋白樣品的區(qū)域，須用合適的試劑進(jìn)行封閉，以減少抗體結(jié)合到膜上形成高背景。

3、選擇優(yōu)質(zhì)抗體
抗體優(yōu)選是低豐度WB檢測(cè)的關(guān)鍵一環(huán)，好的抗體具有高親和性、高特異性等特點(diǎn)。需注意抗體濃度高并不代表結(jié)果好，合理的一抗、二抗以及樣品濃度才能保證良好的ECL顯色。此外，有些情況下可以選擇多克隆抗體，能識(shí)別多個(gè)表位、提高檢測(cè)的靈敏度，對(duì)于豐度偏低的蛋白也更容易檢出。

4、選擇高靈敏度ECL發(fā)光液
做WB實(shí)驗(yàn)時(shí)，ECL發(fā)光液對(duì)于實(shí)驗(yàn)的成功非常重要，用高靈敏度ECL發(fā)光液不僅可曝光得到漂亮的目的條帶，還可以節(jié)約時(shí)間，以及節(jié)約昂貴的抗體成本。

5、選擇高靈敏度、寬定量范圍成像系統(tǒng)
低豐度蛋白檢測(cè)，需要寬定量范圍的成像方式，這樣才能獲取更好的數(shù)據(jù)，更有利于下一步半定量分析。

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