差示掃描熒光法DSF的介紹及其在蛋白質穩(wěn)定性篩選等方面的應用
前言
蛋白質涉及生理的方方面面，要正確地發(fā)揮其作用，它們需要以特定的方式折疊。這些大分子的結構和穩(wěn)定性是保持其活性和功能的重要因素。保持蛋白質結構的穩(wěn)定狀態(tài)對于藥物開發(fā)、給藥和基礎研究至關重要。蛋白質的結構穩(wěn)定性與環(huán)境條件和緩沖液配方直接相關，不同蛋白質的環(huán)境條件和緩沖液配方各不相同。這些因素與蛋白質結構和氨基酸序列有關，決定了蛋白質的緊密程度以及等電點（pI）等。此后，這些參數(shù)通過定義最佳pH值、離子和溫度來確定最佳儲存條件。
應研究蛋白質在不同條件和不同添加劑下的結構，以便深入了解其功能并優(yōu)化條件。這對生物制劑尤為重要。蛋白質工程有助于蛋白質治療，根據(jù)分子類型進行分類，其中規(guī)模最大、增長最快的是抗體藥物。在這一類蛋白質中，單克隆抗體（mAbs）正受到各大制藥和生物技術公司的關注。大多數(shù)mAb多肽鏈可以折疊成特定形狀，這對蛋白質的功能性和穩(wěn)定性至關重要。保持和提供形狀正確的mAb是制藥研發(fā)部門的主要重點之一，這不僅與蛋白質的穩(wěn)定性有關，還與蛋白質的聚集傾向有關。
差示掃描熒光法（DSF）介紹
差示掃描熒光法（Differential Scanning Fluorimetry，DSF），又稱熱遷移分析（Thermal Shift Assay，TSA）或ThermoFluor，是一種成本效益高、可并行化、實用且易于使用的生物物理技術（圖1）。因此，它被廣泛用作跟蹤蛋白質折疊狀態(tài)和穩(wěn)定性以及相互作用等研究。傳統(tǒng)的DSF使用實時熒光定量PCR儀，通過測量優(yōu)先與未折疊蛋白質結合的染料（如SYPRO Orange，它與蛋白質因折疊而暴露的疏水區(qū)域結合）的熒光變化來監(jiān)測熱誘導的蛋白質變性。該實驗也被稱為蛋白質熱遷移分析，因為在加入穩(wěn)定或不穩(wěn)定的結合配體或緩沖成分后，可以測量表觀熔解溫度（Tm）的變化。在有特定化合物或配體結合的情況下，蛋白穩(wěn)定性的上升，表現(xiàn)為熔解溫度的上升。
圖1：使用外部熒光染料的典型蛋白質熱穩(wěn)定性分析數(shù)據(jù)。(A) 溫度的升高將蛋白質推向未折疊狀態(tài)，50%的蛋白質樣品處于折疊狀態(tài)和50%處于未折疊狀態(tài)的溫度被定義為熔解溫度（Tm），對應的熒光強度達到最大熒光值的一半；隨著溫度進一步升高，蛋白質最終聚集而使染料解離，熒光強度降低。(B) 為提高可視化程度，還可將數(shù)據(jù)繪制成熒光曲線（dF/dT）與溫度的對比斜率圖。Tm顯示為一個峰值，ΔTm可以通過配體結合蛋白（紅色）和非結合蛋白（黑色）的峰值之間的距離得到。
與大多數(shù)其他方法相比，DSF的速度很快（20-120分鐘）。它還可用于多種用途，例如，確定純化重組蛋白的穩(wěn)定條件、添加劑和小分子配體以及輔助因子。收集到的數(shù)據(jù)可直接用于研究蛋白質的特性，也可用于指示有利的結晶或儲存條件，或幫助確定功能。DSF的高通量特性允許通過對各種溶液條件（如緩沖液特性、溶液pH值和離子強度）進行稀疏基質篩選，快速發(fā)現(xiàn)蛋白質穩(wěn)定溶液。通常，DSF檢測在96孔板或384孔板中以20 µL的體積進行，最終體積中含有5-10 µM的蛋白質。鑒于這些優(yōu)點，DSF被廣泛應用于學術界、政府和工業(yè)界的實驗室。
差示掃描熒光法（DSF）應用
蛋白質穩(wěn)定性篩選
▪ 改進蛋白質預處理（緩沖液pH值、鹽、輔料、添加劑）
▪ 分析結晶條件
▪ 蛋白質配方和儲存緩沖液優(yōu)化
▪ 突變或修飾對蛋白質穩(wěn)定性的影響
▪ 蛋白質制備質量控制（是否存在雜質或聚集蛋白質）
高通量配體篩選
▪ 小分子和片段庫篩選
▪ 抗體-靶標特異性
▪ 蛋白質-蛋白質相互作用
▪ 抑制劑結合
圖片來源于網絡，侵刪
QX系列實時熒光定量PCR系統(tǒng)
QX系列實時熒光定量PCR系統(tǒng)，采用先進的雙PID算法和溫控技術，結合免維護光學系統(tǒng)和靈活的連接操控方式。這不僅提供了更快的升降溫速度，同時還帶來了更好的溫控精準度和均一性，以確保您實驗數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。配合業(yè)界領先的熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理軟件，QX系列將熒光信號處理、專業(yè)的數(shù)據(jù)計算方法、嚴謹?shù)慕y(tǒng)計學分析功能整合為一站式解決方案，從核酸到蛋白研究，滿足探索各種科學問題的實驗需要，重新定義了科研級熒光定量PCR系統(tǒng)。
蛋白質涉及生理的方方面面，要正確地發(fā)揮其作用，它們需要以特定的方式折疊。這些大分子的結構和穩(wěn)定性是保持其活性和功能的重要因素。保持蛋白質結構的穩(wěn)定狀態(tài)對于藥物開發(fā)、給藥和基礎研究至關重要。蛋白質的結構穩(wěn)定性與環(huán)境條件和緩沖液配方直接相關，不同蛋白質的環(huán)境條件和緩沖液配方各不相同。這些因素與蛋白質結構和氨基酸序列有關，決定了蛋白質的緊密程度以及等電點（pI）等。此后，這些參數(shù)通過定義最佳pH值、離子和溫度來確定最佳儲存條件。
應研究蛋白質在不同條件和不同添加劑下的結構，以便深入了解其功能并優(yōu)化條件。這對生物制劑尤為重要。蛋白質工程有助于蛋白質治療，根據(jù)分子類型進行分類，其中規(guī)模最大、增長最快的是抗體藥物。在這一類蛋白質中，單克隆抗體（mAbs）正受到各大制藥和生物技術公司的關注。大多數(shù)mAb多肽鏈可以折疊成特定形狀，這對蛋白質的功能性和穩(wěn)定性至關重要。保持和提供形狀正確的mAb是制藥研發(fā)部門的主要重點之一，這不僅與蛋白質的穩(wěn)定性有關，還與蛋白質的聚集傾向有關。
差示掃描熒光法（DSF）介紹
差示掃描熒光法（Differential Scanning Fluorimetry，DSF），又稱熱遷移分析（Thermal Shift Assay，TSA）或ThermoFluor，是一種成本效益高、可并行化、實用且易于使用的生物物理技術（圖1）。因此，它被廣泛用作跟蹤蛋白質折疊狀態(tài)和穩(wěn)定性以及相互作用等研究。傳統(tǒng)的DSF使用實時熒光定量PCR儀，通過測量優(yōu)先與未折疊蛋白質結合的染料（如SYPRO Orange，它與蛋白質因折疊而暴露的疏水區(qū)域結合）的熒光變化來監(jiān)測熱誘導的蛋白質變性。該實驗也被稱為蛋白質熱遷移分析，因為在加入穩(wěn)定或不穩(wěn)定的結合配體或緩沖成分后，可以測量表觀熔解溫度（Tm）的變化。在有特定化合物或配體結合的情況下，蛋白穩(wěn)定性的上升，表現(xiàn)為熔解溫度的上升。
與大多數(shù)其他方法相比，DSF的速度很快（20-120分鐘）。它還可用于多種用途，例如，確定純化重組蛋白的穩(wěn)定條件、添加劑和小分子配體以及輔助因子。收集到的數(shù)據(jù)可直接用于研究蛋白質的特性，也可用于指示有利的結晶或儲存條件，或幫助確定功能。DSF的高通量特性允許通過對各種溶液條件（如緩沖液特性、溶液pH值和離子強度）進行稀疏基質篩選，快速發(fā)現(xiàn)蛋白質穩(wěn)定溶液。通常，DSF檢測在96孔板或384孔板中以20 µL的體積進行，最終體積中含有5-10 µM的蛋白質。鑒于這些優(yōu)點，DSF被廣泛應用于學術界、政府和工業(yè)界的實驗室。
差示掃描熒光法（DSF）應用
蛋白質穩(wěn)定性篩選
▪ 改進蛋白質預處理（緩沖液pH值、鹽、輔料、添加劑）
▪ 分析結晶條件
▪ 蛋白質配方和儲存緩沖液優(yōu)化
▪ 突變或修飾對蛋白質穩(wěn)定性的影響
▪ 蛋白質制備質量控制（是否存在雜質或聚集蛋白質）
高通量配體篩選
▪ 小分子和片段庫篩選
▪ 抗體-靶標特異性
▪ 蛋白質-蛋白質相互作用
▪ 抑制劑結合
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QX系列實時熒光定量PCR系統(tǒng)
QX系列實時熒光定量PCR系統(tǒng)，采用先進的雙PID算法和溫控技術，結合免維護光學系統(tǒng)和靈活的連接操控方式。這不僅提供了更快的升降溫速度，同時還帶來了更好的溫控精準度和均一性，以確保您實驗數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。配合業(yè)界領先的熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理軟件，QX系列將熒光信號處理、專業(yè)的數(shù)據(jù)計算方法、嚴謹?shù)慕y(tǒng)計學分析功能整合為一站式解決方案，從核酸到蛋白研究，滿足探索各種科學問題的實驗需要，重新定義了科研級熒光定量PCR系統(tǒng)。
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