用戶文章：基于LC-MS/MS鑒定絲綢種類以提供古代使用野生蠶絲的證據(jù)
蠶絲是一種纖維蛋白，通常通過養(yǎng)殖家蠶（Bombyx mori）來生產(chǎn)。最早使用蠶絲制作紡織品的歷時可以追溯到大約6000年前中國的新石器時代[1]。歷史證據(jù)表明，與此同時或在此之前，可能已有多種蠶種被用于蠶絲采集和紡織品生產(chǎn)[2,3,4]。時至今日，多種野生蠶絲已被用于紡織品生產(chǎn)，例如天蠶（Antheraea）和桑蠶（Samia）。這些物種適應(yīng)在不同的氣候條件下生活（從熱帶到溫帶），棲息在亞洲大部分地區(qū)并具有區(qū)域依賴性。絲綢是連接亞洲與中東和歐洲近 2000年的重要商品[1],在古絲綢之路及附近的考古遺址也發(fā)現(xiàn)了大量疑似絲綢的材料，對這些材料的種類進行鑒定將有助于更好地了解古代和史前時期的絲綢生產(chǎn)概況，可以提供紡織品的使用、技術(shù)發(fā)展以及絲綢貿(mào)易的起源和發(fā)展的重要信息。然而，研究蠶桑業(yè)的起源很困難，因為基于傳統(tǒng)的光學顯微鏡、SEM、FTIR等技術(shù)進行形態(tài)觀察和化學表征很難捕捉到蠶絲物種間的細微變化，古代樣品由于發(fā)生氧化和降解等反應(yīng)，使得難度進一步提高。通過LC-MS/MS可以確定氨基酸序列，然后可以通過遺傳和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫在物種水平上將其與特定蛋白質(zhì)匹配[5]，還可以觀察到由于遺傳漂變和物種形成而導致的同一蛋白質(zhì)在不同物種中發(fā)生氨基酸序列變化[6,7]。
來自英國牛津大學化學系的James S. O. McCullagh教授和考古與藝術(shù)史研究實驗室的A. Mark Pollard教授聯(lián)合發(fā)表了基于質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學方法成功將現(xiàn)代蠶絲（Bombyx）、天蠶絲（Antheraea）和薩米亞蠶絲（Samia）區(qū)分到物種水平的研究: “Species identification of silks by protein mass spectrometry reveals evidence of wild silk use in antiquity” 。多肽和蛋白鑒定使用PEAKS®️ Studio完成。而且，他們分析了從古城巴爾米拉出土的考古蠶絲材料，蠶絲的溶解表現(xiàn)和蛋白質(zhì)組學分析結(jié)果表明這些絲綢是由野生印度柞蠶（Antheraea mylitta）的蠶絲織成的，是首次證明古代印度野生蠶絲參與生產(chǎn)和貿(mào)易的物種級考古生化證據(jù)。
絲素蛋白溶解實驗
圖1 不同蠶絲的溶解條件測試
蛋白參考序列及其理論酶切模式
為了預(yù)估最佳的蛋白酶切方案，作者對Swiss-Prot庫中的B. mori（P05790）和B. mandarina（Q99059），TrEMBL庫中的A. pernyi（O75786）、 A. mylitta（Q8ISB3）、A. yamamai（E1CGA3）、A. assamensis（A0A0K0KR73）和S. ricini（A0A0D5ZYI3）進行了氨基酸序列比對和計算機理論酶切。對比結(jié)果顯示，即使來自于同一個屬，不同物種間的蛋白也存在各自獨有的序列片段（圖2），從而導致在酶切過程中產(chǎn)生不同的肽段，輔助進行物種區(qū)分。然后，作者在PeptideMass在線模擬Trypsin、Chymotrypsin和Trypsin-Chymotrypsin酶切覆蓋度。Trypsin和Chymotrypsin單獨酶切在不同樣品中的覆蓋度并不均勻，但Trypsin-Chymotrypsin聯(lián)合酶切比較穩(wěn)定，在B. mori HC中實現(xiàn)了48％的序列覆蓋率，在B. mandarina HC中實現(xiàn)了100％，在Antheraea中實現(xiàn)了92-100％，在S. ricini中實現(xiàn)了100％，這表明與單獨使用Trypsin相比，Trypsin-Chymotrypsin可為大多數(shù)絲素蛋白提供較高的多肽覆蓋率。
通過LC-MS/MS鑒定不同絲素蛋白
為了確定計算機預(yù)測是否可實際應(yīng)用于不同物種的絲素蛋白區(qū)分，作者首先用7M Ca(NO3)2溶解絲素蛋白，然后分別使用 (1)Trypsin，(2) FA-Trypsin(甲酸后再用胰蛋白酶)，(3) Chymotrypsin，以及 (4) Chymotrypsin-Trypsin(糜蛋白酶后再用胰蛋白酶)四種方法分別對7 種絲素蛋白樣品進行酶切，總得到28 個待測樣品，用于后續(xù)nanoLC-MS/MS分析。質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用PEAKS®️ Studio進行分析。每個物種都鑒定到了特征序列，包括B. mori特有的六肽GAGAGA和GAGAGT（圖3a）、Antheraea特有的肽SGAGG（圖3c）和多聚丙氨酸片段（圖3b、d、e）和S. ricini特有的肽GGGYGGDGG（圖3f）。使用Chymotrypsin消化Bombyx 絲素蛋白的HC、A. pernyi和A. mylitta可鑒定出最多的獨有肽段，但使用Chymotrypsin-Trypsin酶消化A. yamamai、A. assamensis和S. ricini可鑒定出最多的特異肽段。
圖3 七個蠶絲樣品中可信度較高的特異肽段譜圖
帕爾米拉樣品的蠶絲物種鑒定
作者采集了從帕爾米拉考古遺址發(fā)現(xiàn)的五個疑似絲綢的纖維樣本（圖4a），S8號樣品（左）由非常有光澤的扁平纖維制成，根據(jù)之前的顯微鏡分析，只在Z方向軸上有輕微扭曲。S48（中）和S49號（右）樣品的經(jīng)線和緯線看起來都是相似的扁平纖維。據(jù)推測，這三種紡織品都不是由B.mori的蠶絲制成的，但由于缺乏合適的分析技術(shù)[8]，至今無法確認具體成分。因此作者使用上述優(yōu)化的7M Ca(NO3)2溶解樣品，在 40-80 °C之間未觀察到溶解（圖4a），但在100-125°C之間溶解較充分（圖4b、c），與先前使用現(xiàn)代野生蠶絲標準品進行實驗時觀察到的結(jié)果一致。樣本充分溶解后，用Chymotrypsin-Trypsin聯(lián)合酶切，然后通過nanoLC-MS/MS對酶切后的樣品進行分析。表2匯總了數(shù)據(jù)庫搜索（PEAKS DB）與翻譯后修飾搜索（PEAKS PTM）、同源序列匹配（PEAKS SPIDER）分析得到的特異肽段信息。由于A. mylitta絲素蛋白的參考序列不完整，比其他Antheraea物種的蛋白序列短75%以上，為此作者進行了PEAKS SPIDER搜索，將從頭測序（de novo）標簽映射到已知參考序列中高度同源的區(qū)域。
表2 帕爾米拉樣品中特異肽段的鑒定結(jié)果
所有帕爾米拉樣品中均發(fā)現(xiàn)了先前在現(xiàn)代蠶絲樣品中發(fā)現(xiàn)的Antheraea絲素蛋白的特有肽段SGAGG和An≥8片段（表2）。結(jié)合PEAKS DB和PEAKS SPIDER分析，樣品A、B和D的絲素蛋白可以確定來源于A. mylitta（圖4f）。樣品C和E與其他Antheraea蛋白的匹配得分略高，但樣品C中的GGYGSGSSA11SAAR（478–500）和 SA15SGAGGR（176–197），樣品E中的SA11SAAR（485–500），均屬于A. mylitta（表2）。A15S和SSA11S的基序是A.mylitta（Q8ISB3）獨有的，因此對于未知待測樣品，可以檢測這些肽段基序來區(qū)分A. mylitta和其他物種。
小結(jié)
原文鏈接
https://www.nature.com/articles/s41598-022-08167-3
參考文獻
1. Vainker, S. J. Chinese Silk: A Cultural History (British Museum Press, 2004).
2. Gilroy, C. G. The History of Silk, Cotton, Linen, Wool, and Other Fibrous Substances (C. M. Saxton, E. R. Fellows, 1853).
3. Good, I. On the question of silk in pre-Han Eurasia. Antiquity 69, 959–968 (1995).
4. Ray, H. P. Textiles in Indian Ocean Societies (ed. Barnes, R.). (Taylor & Francis, 2004).
5. Zhao, Y. & Lin, Y. H. Whole-cell protein identification using the concept of unique peptides. Genomics Proteomics Bioinform. 8, 33–41. https://doi.org/10.1016/s1672-0229(10)60004-6 (2010).
6.Solazzo, C., Fitzhugh, W., Kaplan, S., Potter, C. & Dyer, J. M. Molecular markers in keratins from Mysticeti whales for species identification of baleen in museum and archaeological collections. PLoS ONE12, e0183053. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0183053 (2017).
7. Azémard, C. et al. Animal fibre use in the Keriya valley (Xinjiang, China) during the Bronze and Iron Ages: A proteomic approach. J. Archaeol. Sci.
8. Schmidt-Colinet, A., Stauffer, A. & Asʻad, K. Die Textilien aus Palmyra. (Ph. von Zabern, 2000).
作為生物信息學的領(lǐng)軍企業(yè)，BSI專注于蛋白質(zhì)組學和生物藥領(lǐng)域，通過機器學習和先進算法提供世界領(lǐng)先的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件和蛋白質(zhì)組學服務(wù)解決方案，以推進生物學研究和藥物發(fā)現(xiàn)。我們通過基于AI的計算方案，為您提供對蛋白質(zhì)組學、基因組學和醫(yī)學的卓越洞見。旗下著名的PEAKS®️系列軟件在全世界擁有數(shù)千家學術(shù)和工業(yè)用戶，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，DeepImmu®️ 免疫肽組發(fā)現(xiàn)服務(wù)和抗體綜合表征服務(wù)等。
來自英國牛津大學化學系的James S. O. McCullagh教授和考古與藝術(shù)史研究實驗室的A. Mark Pollard教授聯(lián)合發(fā)表了基于質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學方法成功將現(xiàn)代蠶絲（Bombyx）、天蠶絲（Antheraea）和薩米亞蠶絲（Samia）區(qū)分到物種水平的研究: “Species identification of silks by protein mass spectrometry reveals evidence of wild silk use in antiquity” 。多肽和蛋白鑒定使用PEAKS®️ Studio完成。而且，他們分析了從古城巴爾米拉出土的考古蠶絲材料，蠶絲的溶解表現(xiàn)和蛋白質(zhì)組學分析結(jié)果表明這些絲綢是由野生印度柞蠶（Antheraea mylitta）的蠶絲織成的，是首次證明古代印度野生蠶絲參與生產(chǎn)和貿(mào)易的物種級考古生化證據(jù)。
絲素蛋白溶解實驗
蠶絲一般由絲膠和絲素蛋白兩部分組成。絲膠是一種膠質(zhì)蛋白，主要由親水鏈組成，通�？赏ㄟ^熱水或溫和的化學處理將其剝離。而絲素蛋白具有疏水性結(jié)構(gòu)，富含短甘氨酸和丙氨酸殘基，可實現(xiàn)β片層緊密堆積和氨基酸R基互鎖排列，不易被溶解，且野生蠶絲比家蠶絲更難溶解。Bombyx蛋白包含重鏈（HC，390kDa）、輕鏈（LC，30kDa）和六肽（P25，25kDa），Antheraea和Samia蛋白僅包含通過二硫鍵連接的重鏈。為了充分溶解來自不同物種的絲素蛋白以便進行更準確的蛋白質(zhì)組學鑒定，作者配置了5種溶液體系，分別對B. mori、B. mandarina、A.pernyi、A. mylitta、A. yamamai、A. assamensis和S. ricini七種蠶絲進行溶解測試（圖1a）。溶解效果通過黃色反應(yīng)測定（圖1b，c），結(jié)果顯示不同的鹽溶液對不同種類的絲素蛋白的溶解度不同，溶解所需的加熱溫度也因絲的類型而異。
圖1 不同蠶絲的溶解條件測試蛋白參考序列及其理論酶切模式
為了預(yù)估最佳的蛋白酶切方案，作者對Swiss-Prot庫中的B. mori（P05790）和B. mandarina（Q99059），TrEMBL庫中的A. pernyi（O75786）、 A. mylitta（Q8ISB3）、A. yamamai（E1CGA3）、A. assamensis（A0A0K0KR73）和S. ricini（A0A0D5ZYI3）進行了氨基酸序列比對和計算機理論酶切。對比結(jié)果顯示，即使來自于同一個屬，不同物種間的蛋白也存在各自獨有的序列片段（圖2），從而導致在酶切過程中產(chǎn)生不同的肽段，輔助進行物種區(qū)分。然后，作者在PeptideMass在線模擬Trypsin、Chymotrypsin和Trypsin-Chymotrypsin酶切覆蓋度。Trypsin和Chymotrypsin單獨酶切在不同樣品中的覆蓋度并不均勻，但Trypsin-Chymotrypsin聯(lián)合酶切比較穩(wěn)定，在B. mori HC中實現(xiàn)了48％的序列覆蓋率，在B. mandarina HC中實現(xiàn)了100％，在Antheraea中實現(xiàn)了92-100％，在S. ricini中實現(xiàn)了100％，這表明與單獨使用Trypsin相比，Trypsin-Chymotrypsin可為大多數(shù)絲素蛋白提供較高的多肽覆蓋率。
圖2 不同蠶絲的特異序列（部分）
通過LC-MS/MS鑒定不同絲素蛋白
為了確定計算機預(yù)測是否可實際應(yīng)用于不同物種的絲素蛋白區(qū)分，作者首先用7M Ca(NO3)2溶解絲素蛋白，然后分別使用 (1)Trypsin，(2) FA-Trypsin(甲酸后再用胰蛋白酶)，(3) Chymotrypsin，以及 (4) Chymotrypsin-Trypsin(糜蛋白酶后再用胰蛋白酶)四種方法分別對7 種絲素蛋白樣品進行酶切，總得到28 個待測樣品，用于后續(xù)nanoLC-MS/MS分析。質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用PEAKS®️ Studio進行分析。每個物種都鑒定到了特征序列，包括B. mori特有的六肽GAGAGA和GAGAGT（圖3a）、Antheraea特有的肽SGAGG（圖3c）和多聚丙氨酸片段（圖3b、d、e）和S. ricini特有的肽GGGYGGDGG（圖3f）。使用Chymotrypsin消化Bombyx 絲素蛋白的HC、A. pernyi和A. mylitta可鑒定出最多的獨有肽段，但使用Chymotrypsin-Trypsin酶消化A. yamamai、A. assamensis和S. ricini可鑒定出最多的特異肽段。
圖3 七個蠶絲樣品中可信度較高的特異肽段譜圖帕爾米拉樣品的蠶絲物種鑒定
作者采集了從帕爾米拉考古遺址發(fā)現(xiàn)的五個疑似絲綢的纖維樣本（圖4a），S8號樣品（左）由非常有光澤的扁平纖維制成，根據(jù)之前的顯微鏡分析，只在Z方向軸上有輕微扭曲。S48（中）和S49號（右）樣品的經(jīng)線和緯線看起來都是相似的扁平纖維。據(jù)推測，這三種紡織品都不是由B.mori的蠶絲制成的，但由于缺乏合適的分析技術(shù)[8]，至今無法確認具體成分。因此作者使用上述優(yōu)化的7M Ca(NO3)2溶解樣品，在 40-80 °C之間未觀察到溶解（圖4a），但在100-125°C之間溶解較充分（圖4b、c），與先前使用現(xiàn)代野生蠶絲標準品進行實驗時觀察到的結(jié)果一致。樣本充分溶解后，用Chymotrypsin-Trypsin聯(lián)合酶切，然后通過nanoLC-MS/MS對酶切后的樣品進行分析。表2匯總了數(shù)據(jù)庫搜索（PEAKS DB）與翻譯后修飾搜索（PEAKS PTM）、同源序列匹配（PEAKS SPIDER）分析得到的特異肽段信息。由于A. mylitta絲素蛋白的參考序列不完整，比其他Antheraea物種的蛋白序列短75%以上，為此作者進行了PEAKS SPIDER搜索，將從頭測序（de novo）標簽映射到已知參考序列中高度同源的區(qū)域。
表2 帕爾米拉樣品中特異肽段的鑒定結(jié)果
所有帕爾米拉樣品中均發(fā)現(xiàn)了先前在現(xiàn)代蠶絲樣品中發(fā)現(xiàn)的Antheraea絲素蛋白的特有肽段SGAGG和An≥8片段（表2）。結(jié)合PEAKS DB和PEAKS SPIDER分析，樣品A、B和D的絲素蛋白可以確定來源于A. mylitta（圖4f）。樣品C和E與其他Antheraea蛋白的匹配得分略高，但樣品C中的GGYGSGSSA11SAAR（478–500）和 SA15SGAGGR（176–197），樣品E中的SA11SAAR（485–500），均屬于A. mylitta（表2）。A15S和SSA11S的基序是A.mylitta（Q8ISB3）獨有的，因此對于未知待測樣品，可以檢測這些肽段基序來區(qū)分A. mylitta和其他物種。
圖4 古代絲綢樣品的物種鑒定
小結(jié)
本研究優(yōu)化了不同種類蠶絲的最佳溶解方法，并通過nanoLC-MS/MS進行物種識別。該方法通過提供絲素蛋白組成的直接分子證據(jù)（包括以前無法從野生絲素蛋白中獲得的物種水平信息），克服了一些傳統(tǒng)絲綢識別技術(shù)的局限性。該方法已成功應(yīng)用于七種現(xiàn)代絲綢物種的分析，隨后還用于分析古代帕爾米拉的考古絲綢樣品。首次提供了古代使用印度野生柞蠶（A. mylitta）蠶絲生產(chǎn)和出口絲綢的直接證據(jù)。但由于目前公開的絲蛋白參考序列不完整，尤其是B. mandarina和A. mylitta，豐富與蠶絲素蛋白有關(guān)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫將使得本研究方法得到更廣泛的應(yīng)用，并提高對嚴重降解或污染的考古絲綢樣品進行分析的成功率。本方法還為研究工程液態(tài)絲綢提供了參考，有望在材料科學領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)新的廣泛應(yīng)用。
原文鏈接
參考文獻
1. Vainker, S. J. Chinese Silk: A Cultural History (British Museum Press, 2004).
2. Gilroy, C. G. The History of Silk, Cotton, Linen, Wool, and Other Fibrous Substances (C. M. Saxton, E. R. Fellows, 1853).
3. Good, I. On the question of silk in pre-Han Eurasia. Antiquity 69, 959–968 (1995).
4. Ray, H. P. Textiles in Indian Ocean Societies (ed. Barnes, R.). (Taylor & Francis, 2004).
5. Zhao, Y. & Lin, Y. H. Whole-cell protein identification using the concept of unique peptides. Genomics Proteomics Bioinform. 8, 33–41. https://doi.org/10.1016/s1672-0229(10)60004-6 (2010).
6.Solazzo, C., Fitzhugh, W., Kaplan, S., Potter, C. & Dyer, J. M. Molecular markers in keratins from Mysticeti whales for species identification of baleen in museum and archaeological collections. PLoS ONE12, e0183053. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0183053 (2017).
7. Azémard, C. et al. Animal fibre use in the Keriya valley (Xinjiang, China) during the Bronze and Iron Ages: A proteomic approach. J. Archaeol. Sci.
8. Schmidt-Colinet, A., Stauffer, A. & Asʻad, K. Die Textilien aus Palmyra. (Ph. von Zabern, 2000).
標簽：
多肽鑒定
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