DAP-seq助力揭示番茄抗酸鋁分子調(diào)控新機制
2024年10月2日，云南農(nóng)業(yè)大學園林園藝學院營養(yǎng)逆境與品質(zhì)改良楊建立/范偉團隊在Horticulture Research期刊(IF=7.6)上在線發(fā)表題為“SlSTOP1-regulated SlHAK5 expression confers Al tolerance in tomato by facilitating citrate secretion from roots”的研究論文。該研究通過DAP-seq和RNA-seq在全基因組水平挖掘了番茄抗酸鋁核心轉錄因子SlSTOP1互作位點，明確了受SlSTOP1直接調(diào)控的抗酸鋁基因，并對其中一個與鉀離子轉運有關的轉運蛋白基因SlHAK5在抗酸鋁中的功能進行了解析。
云南省酸性土壤占了土地面積50%左右，在pH低于5.5的酸性耕地中，44%為旱地，33%為水田。土壤酸化導致的酸鋁脅迫，礦質(zhì)營養(yǎng)元素缺乏，以及土傳病害高發(fā)，嚴重制約著云南省農(nóng)作物的優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)。Cys2His2型鋅指結構轉錄因子STOP1在高等植物中既保守又功能多變，而番茄中SlSTOP1調(diào)控抗酸鋁的分子生理機制仍未得到系統(tǒng)研究。
為了鑒定SlSTOP1蛋白的全基因組結合靶點，作者進行了DNA親和純化測序（DAP-seq）實驗。兩個重復中共有peak數(shù)量為7824個，分布在不同染色體上。這些結合位點主要集中在基因轉錄起始位點（TSS）周圍2 Kb的區(qū)域內(nèi)，其中有68%的結合位點位于基因間區(qū)。同時鑒定到SlSTOP1結合的motif：5′-CCTTCCCCAGATAA-3′。
為了鑒定SlSTOP1蛋白的全基因組結合靶點，作者進行了DNA親和純化測序（DAP-seq）實驗。兩個重復中共有peak數(shù)量為7824個，分布在不同染色體上。這些結合位點主要集中在基因轉錄起始位點（TSS）周圍2 Kb的區(qū)域內(nèi)，其中有68%的結合位點位于基因間區(qū)。同時鑒定到SlSTOP1結合的motif：5′-CCTTCCCCAGATAA-3′。
圖1 通過DAP-seq技術鑒定SlSTOP1在全基因組的結合位點
為了確定SlSTOP1在鋁脅迫下的直接靶點，作者對多組樣本進行了轉錄組測序，將RNA-seq中的327個overlap DEGs與DAP-seq中的啟動子靶向基因進行聯(lián)合分析。結果發(fā)現(xiàn)，在鋁脅迫下SlSTOP1通過與39個基因的啟動子結合進行轉錄調(diào)控。這些SlSTOP1直接調(diào)控的Al應答基因在功能上可分為轉運體、轉錄因子、信號傳導、代謝等基因。39個基因中有7個與已知的耐鋁基因同源，表明這些目標基因可能是番茄中最重要的耐鋁基因。作者將基因SlRAE1、SlSTAR1、SlHAK5和SlAAE3-1進行可視化，發(fā)現(xiàn)SlSTOP1與這些基因的結合位點位于tss附近。隨后作者挑選了SlHAK5基因進行雙熒光素酶報告實驗和EMSA驗證。
圖2 SlSTOP1與Al調(diào)控基因簇的結合及其直接調(diào)控
本研究成功挖掘到酸鋁脅迫下受SlSTOP1直接調(diào)控的39個下游靶基因，包括課題組先前發(fā)現(xiàn)的甲酸鹽脫氫酶基因SlFDH（The Plant Journal,2023,113:387–401；doi: 10.1111/tpj.16054）和本研究中揭示的鉀離子轉運蛋白基因SlHAK5。上述研究的發(fā)現(xiàn)進一步闡明了番茄抗酸鋁核心分子調(diào)控網(wǎng)絡，為創(chuàng)制耐酸鋁番茄新種質(zhì)奠定了基礎。
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