新學(xué)期開始，剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的“實(shí)驗(yàn)小白”開始苦惱了：師兄師姐都說PCR實(shí)驗(yàn)很簡(jiǎn)單，然而我的PCR實(shí)驗(yàn)卻反復(fù)沒有結(jié)果，實(shí)在讓人頭疼。

不要急，本文整理了PCR實(shí)驗(yàn)中可能遇到的一些問題，幫助大家輕松掌握PCR實(shí)驗(yàn)！

1. 1、PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間

一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。

2. 2、假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶

一、模板核酸的制備：模板中含有雜蛋白質(zhì)、Taq酶抑制劑；在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚；模板核酸提取過程出現(xiàn)問題。

二、酶的質(zhì)量及活性：酶失活需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。

三、引物的質(zhì)量與特異性：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。

引物設(shè)計(jì)對(duì)策：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不 夠，引物之間形成二聚體等。

四、PCR循環(huán)條件：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。因此擴(kuò)增儀溫度的準(zhǔn)確性和均一性是獲得穩(wěn)定擴(kuò)增的保障。

艾普拜生物的精衛(wèi)自動(dòng)PCR儀采用鍍金槽的設(shè)計(jì)，不僅具有優(yōu)異的熱傳導(dǎo)性能，能夠快速且均勻地傳遞熱量，使PCR反應(yīng)體系中的溫度變化更加迅速和準(zhǔn)確，可以提高反應(yīng)的效率和特異性，減少非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)。而且具有良好的溫度均勻性，使得熱量能夠在槽內(nèi)均勻分布，確保每個(gè)樣品孔位的溫度基本一致，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。

3. 3、假陽性

出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。

一、引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。

二、靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：整個(gè)基因組或大片段的交叉污染或者是空氣中的小片段核酸污染。 

4. 3、出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶

PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。

非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。

其次是酶的質(zhì)量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

  精衛(wèi)自動(dòng)PCR儀  

精衛(wèi)自動(dòng)PCR儀有Kingwell 96、Kingwell 96DW和Kingwell 384三款型號(hào)可選，能夠滿足不同通量的實(shí)驗(yàn)需求。所有型號(hào)均采用鍍金樣品槽，能夠帶來更好的溫控性能和更快的升降溫速度。同時(shí)所有型號(hào)均采用簡(jiǎn)潔現(xiàn)代的外觀設(shè)計(jì)，搭配10.1英寸彩色觸控屏和智能化操作系統(tǒng)，帶來更高效便捷的實(shí)驗(yàn)體驗(yàn)。