一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：
1、pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-02-1000
2、待檢測(cè)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液或細(xì)胞沉淀，
3、Elisa試劑盒
4、酶標(biāo)儀
5、37攝氏度烘箱
6、離心管、96孔板等

二、實(shí)驗(yàn)步驟：
1、試劑準(zhǔn)備
①細(xì)胞培養(yǎng)上清液配制：用無菌管收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，2000-3000rpm離心20分鐘，仔細(xì)收集上清液
②洗滌液配制：蒸餾水1:20稀釋。
③標(biāo)準(zhǔn)品配制：取7個(gè)1.5ml離心管，分別標(biāo)注S2,S3,S5,S6,S7,blank，分別加入樣品稀釋液/標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)沖，標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分別為4000，2000，1000，500，250，125，6.25，0。
④生化素抗體工作液配制：使用前20分鐘稀釋100倍
⑤SABC復(fù)合物工作液配制：使用前20分鐘稀釋100倍
⑥TMB顯色液配制：使用前10分鐘，A:B 1:1混合，避光保存。

2、檢測(cè)程序

①加樣：空白孔用pipetty移液器加入50ul標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液，其余孔加入標(biāo)準(zhǔn)品/待測(cè)樣品50ul，貼上封板膠，37攝氏度，40分鐘放置。
②洗板：每一個(gè)孔加入300ul洗滌液震蕩浸泡2分鐘，濾紙印干。
③加抗體：空白孔加入100ul生物素化抗體稀釋液，其余孔各加入 1x的生物素化抗體工作液100ul，貼上封板膠。
④洗板：同上。
⑤加SABC:空白孔加入 100ul SABC 稀釋液，其余孔各加SABC 復(fù)合物工作液 100ul，貼上封板膠紙，混勻后置37攝氏度，30分鐘。
⑥洗板：同上。
⑦顯色：每孔加入提前配置好的TMB 混合液 100ul，貼上封板膠紙，混勻后置37°C暗處反應(yīng) 10-20分鐘 （具體顯色時(shí)間根據(jù)顯色結(jié)果而定）。
⑧將pipetty移液器調(diào)到混勻模式，混勻，然后每孔加入 100ul 終止液，30 分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀 在450nm 處測(cè)吸光值。

3、結(jié)果判斷與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD 值作縱坐標(biāo)，手工繪制或用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品 OD值計(jì)算出相應(yīng)含量，再乘以稀釋倍數(shù)即可。
 
小tips在這：
1.顯色底物現(xiàn)配現(xiàn)用，避免污染，還有前面需要配制的試劑也是如此.
2.使用前檢查底物在加入96孔板之前應(yīng)為無色透明，這個(gè)非常重要.
3.孵育時(shí)間，按說明書條件來，顯色需要根據(jù)顏色變化來判斷是否可以終止反應(yīng).