研究背景
Nature：清北團隊合作發(fā)現(xiàn)CRISPR免疫增效子，建立Cas9核酸酶生長進化模型

CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種強大的基因編輯工具，但Cas9核酸酶活性仍需提高�，F(xiàn)有的方法存在著種種局限性，例如優(yōu)化序列可能破壞結構、改變表達方式可能導致副作用、使用輔助蛋白會增加復雜性等。因此，開發(fā)新的方法來增強Cas9核酸酶的活性仍是CRISPR-Cas系統(tǒng)研究中的一個重要課題。

2024年5月29日，來自清華大學和北京大學的研究團隊在Nature上合作發(fā)表了題為：Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity的研究論文

研究團隊通過生物信息學分析、結構生長軌跡分析、生化實驗、冷凍電鏡解析和大腸桿菌抗噬菌體實驗等手段，發(fā)現(xiàn)了一類新型CRISPR免疫增效子PcrIIC1，可以顯著增強Cas9核酸酶的活性。研究團隊還建立了Cas9核酸酶生長進化模型，揭示了Cas9蛋白結構和功能的演變規(guī)律，并闡明了PcrIIC1增強Cas9活性的分子機制。這項研究為我們進一步理解CRISPR系統(tǒng)的進化歷程，以及開發(fā)基于CRISPR免疫增效子的高效基因編輯工具奠定了基礎。
 

圖1. 結構生長軌跡分析方法（左）和II-C型Cas9的生長軌跡圖（右）

通過生化實驗和冷凍電鏡解析復合體結構表明，來自金黃色細菌屬（Chryseobacterium sp.）的CbCas9生長出了一個全新的增強Cas9活性的β-REC2結構域，以及一個全新的能夠與其關聯(lián)基因PcrIIC1互作的CTH結構域。通過蛋白間相互作用，2個CbCas9蛋白和2個PcrIIC1蛋白能夠形成異源四聚體復合物。
 

圖2. 冷凍電鏡分析CbCas9和PcrIIC1結合的三個階段

蛋白質與核酸的分子互作實驗表明，與單獨的CbCas9相比，CbCas9-PcrIC1復合物表現(xiàn)出增強的DNA結合進而體現(xiàn)出切割活性，對原間隔區(qū)相鄰基序序列的兼容性更廣，對錯配的耐受性更強，抗噬菌體免疫性增強。

研究利用溶液中標記的分子互作方式獲得親和力，得出與單獨的CbCas9相比，CbCas9-PcrIC1復合物表現(xiàn)出增強的DNA結合（圖3a）進而體現(xiàn)出切割活性，對原間隔區(qū)相鄰基序序列的兼容性更廣，對錯配的耐受性更強，抗噬菌體免疫性增強。
 

圖3. PcrIIC1增強CbCas9的DNA結合(a)、切割(b)、PAM兼容性(c)、DNA解旋 (d) 和錯配容忍 (e) 能力

最后，為了檢驗CRISPR免疫增效子PcrIIC1對CbCas9抗噬菌體免疫能力的影響，研究人員在大腸桿菌中進行了抗噬菌體實驗。以上結果說明CbCas9-PcrIIC1復合體的形成對整個CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫增強至關重要。
 

圖4. PcrIIC1顯著增強了CbCas9系統(tǒng)的細菌免疫活性

FIDA如何更好復現(xiàn)Nature蛋白與核酸互作發(fā)文思路

流體動力分散技術（FIDA）通過第一性物理原理直接獲取分子的絕對流體動力學半徑（R_h），通過追蹤分子微妙的變化來表征生物分子的行為、特征以及功能。Fida Neo分子互作儀涵蓋親和力表征、親和動力學表征、分子質量表征三大功能，一次實驗即可獲得互作與分子質控的數(shù)據(jù)，讓互作的數(shù)據(jù)有“法”可依。FIDA技術無需固定、無需加熱，甚至無需標記，可兼容所有緩沖液，是對現(xiàn)有分子互作技術是一次革命性的升級。

FIDA技術可用于CbCas9-PcrIIC1復合物冷凍電鏡前樣品質控，CbCas9-PcrIC1復合物與DNA的親和力實驗以及動力學實驗，以及CRISPR- cas以及核酸復合物的大小和定量表征等方面，具體如下:

• FIDA多維蛋白復合體表征，快速無稀釋優(yōu)化冷凍電鏡樣品，豐富您的蛋白質表征數(shù)據(jù)。

FIDA所獲得的R_h為絕對的粒徑大小，可以直接與后期的電鏡數(shù)據(jù)做比較。此外FIDA內置的 PDB 關聯(lián)程序，可以將實際獲得的 R_h 與數(shù)據(jù)庫中的結構信息進行比較，有助于結構的精細解析。

FIDA技術單次運行只需要40 nL 蛋白質在 4 分鐘內獲得的完整蛋白質 QC 圖，包括冷凍電鏡樣品QC的關鍵參數(shù)表征，例如多分散性指數(shù)（PDI），聚集（Agg），粘度（Viscosity），粘附性（Stickiness），完整性（R_h）等指標，F(xiàn)IDA是一種非常有效的支持所有生物物理學和結構生物學的基本工具。
 

圖5. FIDA單次測試的得到8個蛋白表征數(shù)據(jù)

冷凍電鏡應用：FIDA：4分鐘給您無稀釋的冷凍電鏡樣品優(yōu)化解決方案

• FIDA和本篇研究中應用的分子互作技術都是一種在溶液狀態(tài)下通過熒光分子標記表征分子互作的技術。對于蛋白可能需要形成多聚體，在溶液環(huán)境下，更能有效的體現(xiàn)蛋白與蛋白或蛋白與核酸互作的真實情況。

FIDA 可以使用含鹽和洗滌劑的緩沖液條件，具有不同環(huán)境中（類體內環(huán)境）進行測試的靈活性。這使得研究者能夠分析不受緩沖液成分限制的核苷酸，以確保其數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。

FIDA 這種在溶液內檢測分子互作技術，是理想的結合能力檢測，因為它不依賴于潛在的阻礙性表面固定，不受結合域空間方向影響的表征。
 

圖6. FIDA實驗原理示意圖

• FIDA不僅可以表征互作親和力，也同時無標記檢測CRISPR核酸酶與gDNA相互作用的熱力學、親和力、和結合動力學，全面表征蛋白與核酸互作。

FIDA不僅可以完成本研究中得到的CbCas9-PcrIC1復合物表現(xiàn)出增強的DNA結合親和力，還可在無標記下表征蛋白與核酸的熱力學參數(shù)與結合動力學，甚至表征結合時蛋白構象變化與獲得有關基因編輯過程的分子細節(jié)的定量表征。

FIDA技術可以處理帶負電荷分析物和帶正電荷配體，使利用FIDA能夠深入了解CRISPR- cas組分之間的結合相互作用，并以更高的準確性和效率表征和優(yōu)化CRISPR系統(tǒng)。

FIDA是一種序列無關的技術-不需要事先了解序列。FIDA的序列獨立性質可對未知或未表征的基因組區(qū)域進行研究，同時簡化工作流程。
 

圖7.(A) FIDA實驗示意圖。ReporterRNA用于識別RNP的大小和飽和點(上)，用其報告RNP結構作為競爭分析的起點(下);(B)正向結合(上)和反向滴定(下)期間獲得的原始FIDA數(shù)據(jù);

本研究在分子層面直觀的揭示了免疫增效子PcrIIC1的作用。首次發(fā)現(xiàn)了一類新型的CRISPR免疫增效子可以通過二聚化Cas9效應器提升Cas9活性，這些結果不僅有助于我們進一步理解CRISPR系統(tǒng)的進化歷程，還為未來基于CRISPR免疫增效子的高效基因編輯工具的開發(fā)奠定了基礎。

FIDA對于蛋白質復合體的多維表征和對蛋白與核酸互作親和力與動力學的的檢測，不依賴于分子量變化，樣本用量少（僅需40nL），是一種在溶液狀態(tài)下且不受緩沖液成分影響的多維表征技術。對于在本研究中相似的蛋白可能需要形成多聚體，在溶液環(huán)境下，更能有效的體現(xiàn)互作的真實情況。