類器官crispr-cas9基因編輯及慢病毒轉染實驗方法
近幾年，類器官研究十分火熱，在信號通路機制，藥篩藥敏等研究中對類器官模型需求激增，其中利用crispr-cas9基因編輯技術對類器官進行敲低或敲減來造模是個不錯的實驗方法，今天小愛帶大家來了解crispr-cas9基因編輯技術及慢病毒轉染方法。
crispr基因編輯技術中有三個最為重要的組成部分：crRNA、sgRNA和Cas9蛋白。crRNA與Cas9蛋白形成復合物，sgRNA指引（crRNA/cas9）復合物靶向目的DNA區(qū)域定向切割DNA，從而達到基因編輯的目的。
圖1 crispr-cas9基因編輯技術示意圖
crispr-cas9基因編輯技術大體上有三種技術路線：All in one質粒轉染法，病毒轉化法，RNP復合物導入法。病毒轉化法是將sgRNA、crRNA和表達cas9蛋白的序列整合進病毒中，再使用病毒感染細胞。相較于質粒轉染法，優(yōu)點在于sgRNA、crRNA和表達cas9蛋白可以持續(xù)存在于細胞中，從而達到一個很高的基因編輯效果。
圖2 慢病毒轉染細胞示意圖
很多小伙伴對類器官轉染方法十分好奇，類器官慢病毒轉染和細胞轉染大同小異，主要有以下幾個問題需要注意：
1、類器官在進行慢病毒轉染時需不需要從基質膠里解離出來？
考慮到病毒對于基質膠的穿透性及轉染效率，轉染時建議將類器官從基質膠中解離出來，用適當培養(yǎng)基重懸在孔板內進行。
2、類器官在進行慢病毒轉染時需不需要消化成單個細胞？
類器官在進行慢病毒轉染時，消化成單個細胞來轉染效率比較高，建議消化成單個細胞進行感染。
3、類器官轉染慢病毒多長時間合適？
轉染時間可根據(jù)實際實驗情況調整，通常是轉染12-36小時，可以借鑒細胞轉染時間。
4、類器官篩選時要不要消化成單個細胞？如果不需要消化，從膠里解離出來就行？還是在基質膠里就行？
類器官篩選不需要消化成單個細胞，在基質膠里就可以篩選，大部分的藥物都可以穿透基質膠，作用到類器官上。
以下給大家整理了類器官轉染步驟：
1）收集類器官并消化成單個細胞后，按2×105/孔鋪到24孔板中（細胞密度可以自行摸索）；
2）用含有6μg/ml polybrene（polybrene的濃度可以自行摸索）的1ml新鮮類器官培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入適量病毒懸液，37℃孵育；
3）（對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟）4小時后加入1ml新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene；
4）繼續(xù)培養(yǎng)12-36小時后，如有少量細胞貼壁，可用槍頭輕柔吹打下來，混勻，將細胞培養(yǎng)基混懸液收集至離心管中（一般是6-8孔為一組）。300g 4℃ 富集離心5min后移去上清，添加1ml左右類器官傳代培養(yǎng)緩沖液（abs9730）轉移到1.5mlEP管，重新重懸離心；
5）觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質膠（abs9495）重懸混勻（金屬冰盒或冰上操作）；
6）以24孔細胞培養(yǎng)板為例，每孔點膠25ul組織基質膠混合物進行鋪板（金屬冰盒或冰上操作），將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加500-750μl 類器官培養(yǎng)基（恢復室溫）進行培養(yǎng)；
7）待類器官出現(xiàn)明顯增殖現(xiàn)象（一般需要2-3天），更換含有藥物的類器官培養(yǎng)基進行篩選（如嘌呤霉素等），沒有轉染成功的類器官將會裂解凋亡，從而篩出成功轉染的類器官；
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