摘要

反相蛋白微陣列 (RPPA) ，已被證明是對大型患者隊列進(jìn)行生物標(biāo)志物評估的有用工具。使用經(jīng)過驗證的抗體，可在單個實驗跟蹤細(xì)胞命運的生物標(biāo)志物。這項技術(shù)的挑戰(zhàn)之一是動態(tài)范圍，因為在同一隊列中，生物標(biāo)志物的表達(dá)水平可能從飛摩爾 (fM) 到微摩爾 (µM) 濃度不等。已經(jīng)開發(fā)了幾種技術(shù)來跟蹤生物標(biāo)志物的表達(dá)。熒光檢測已被證明較比色和化學(xué)發(fā)光檢測更靈敏。然而，所有這些技術(shù)都必須進(jìn)行優(yōu)化以克服動態(tài)范圍有限的挑戰(zhàn)。一種解決方案是對樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋。然而，這增加了 RPPA 的復(fù)雜性，并使數(shù)據(jù)解析非常繁瑣。此外，連續(xù)稀釋會增加 RPPA 成本，因為每個實驗需要幾張芯片。這里，我們將描述從比色檢測到熒光檢測的方法轉(zhuǎn)變過程中，如何使用 InnoScan 710-IR 掃描儀動態(tài)范圍擴展 (XDR) 功能，大幅降低 RPPA 成本。

正文

蛋白質(zhì)被認(rèn)為是細(xì)胞對內(nèi)源性或外源性刺激反應(yīng)的主要效應(yīng)分子。當(dāng)刺激發(fā)生時，細(xì)胞通過調(diào)節(jié)“關(guān)鍵”蛋白質(zhì)的表達(dá)來改變細(xì)胞功能。這些“關(guān)鍵”蛋白質(zhì)被稱為生物標(biāo)志物。反相蛋白質(zhì)微陣列 (RPPA) 旨在跟蹤數(shù)百或數(shù)千個樣本中的生物標(biāo)志物。在 RPPA 技術(shù)中，細(xì)胞裂解物被點在載玻片上，并通過使用經(jīng)過驗證的抗體，以非常簡單的方式檢測生物標(biāo)志物的表達(dá)（圖 1）。 RPPA其實就是小型化斑點印記（dot blots）實驗。
為了在免疫檢測中對蛋白質(zhì)成像，使用標(biāo)記的二抗。二抗可以與熒光蛋白（熒光團(tuán)）或堿性磷酸酶 (AP) 或辣根過氧化物酶 (HRP) 等酶結(jié)合。在酶檢測中，當(dāng)添加酶底物時，有色沉淀物沉積在載玻片上（比色檢測）或形成化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物，其光信號被適當(dāng)?shù)臋z測器捕獲（化學(xué)發(fā)光檢測）。在熒光檢測中，在免疫檢測過程中直接使用標(biāo)記有熒光團(tuán)的一抗或二抗。在這種情況下，可以使用適當(dāng)?shù)膾呙鑳x（例如Innopsys 的 InnoScan 掃描儀），進(jìn)行熒光信號檢測。與比色法和化學(xué)發(fā)光檢測相比，熒光檢測已被證明具有多項優(yōu)勢；主要優(yōu)點是靈敏度和動態(tài)范圍。






























圖 1.RPPA 工作流程。橙色標(biāo)記了影響耗材成本的關(guān)鍵步驟。連續(xù)稀釋樣品會增加成本；帶或不帶 XDR 檢測的熒光檢測將 RPPA 總體成本降低了至少 30%。




圖 2. 動態(tài)范圍擴展 (XDR)。為了解決樣品間蛋白質(zhì)表達(dá)水平差異大的問題，Innopsys 開發(fā)了一種掃描模式，可以在保持微弱信號的同時避信號飽和。 A) 以手動模式掃描的 RPPA 芯片；圖像是動態(tài)范圍為 10⁴ 的 16 位 TIF 圖像。 B) 使用 XDR 掃描模式掃描的同一芯片；圖像是動態(tài)范圍高于 10⁶ 對數(shù)的 20 位 TIF 圖像


熒光檢測的動態(tài)范圍是化學(xué)發(fā)光檢測的 10 倍，因此檢測限內(nèi)的線性更好，使信號量化更準(zhǔn)確。RPPA實驗 的最大挑戰(zhàn)之一是檢測蛋白表達(dá)變化所需的動態(tài)范圍。一些生物標(biāo)志物的動態(tài)范圍可達(dá) 10⁶，這意味著它們可以在某些樣品中以飛摩爾 (fM) 濃度存在，而在其他樣品中以微摩爾 (µM) 濃度存在。10⁶ 動態(tài)范圍超出了具備10³ 或 10⁴ 動態(tài)范圍檢測設(shè)備的檢測范圍。為了克服這個問題，應(yīng)該對每個樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋以擴大檢測動態(tài)范圍，但必須使用信號放大系統(tǒng)來檢測弱表達(dá)的生物標(biāo)志物。此過程使數(shù)據(jù)分析和解析更加復(fù)雜，因為每個樣品都需要五個或更多稀釋梯度才能包含在分析中。此外，連續(xù)稀釋樣品會增加測定成本，因為實驗所需的載玻片數(shù)量會增加一倍或三倍，從而增加耗材成本。 Innopsys 通過在其掃描儀型號中加入動態(tài)范圍擴展 (XDR) 模式解決了這個問題。使用 XDR 模式，信號檢測動態(tài)范圍從 10⁴擴展到 10⁶ 以上，因此能夠在單次掃描中檢測低信號和高信號（圖 2）。XDR 模式已被證明可以保持不同樣本之間的數(shù)據(jù)分布不變，這在比較來自不同樣本的信號時必不可少。 借助 XDR 功能，不再需要連續(xù)稀釋，從而減少了每次實驗的載玻片數(shù)量，從而降低最終成本。

圖 3 描述了一個 RPPA 實驗室以每年生產(chǎn)約 300 張芯片的成本估算。在此示例中，參考實驗室估計，使用熒光檢測可以通過進(jìn)行相同的樣品系列稀釋，為相同數(shù)量的載玻片節(jié)省大約 30% 的耗材成本。通過 InnoScan 710-IR 掃描儀熒光檢測和 XDR 掃描模式，載玻片數(shù)量減少 3 倍，耗材成本降低90%。




圖 3. 年耗材成本估算。我們的參考實驗室估算了 300 張載玻片的年耗材成本，并比較了不同的檢測方法。成本以美元表示，并根據(jù) 2014 年耗材目錄價。通過使用近紅外 (NIR) 熒光檢測代替比色檢測，可將耗材成本降低 30%。通過使用 NIR 熒光檢測結(jié)合 XDR 掃描模式，載玻片數(shù)量可以減少 3倍，與比色檢測相比，成本節(jié)省高達(dá) 90%。


總之，熒光檢測已被證明是一種有用的檢測工具，具有以下幾個優(yōu)點：(i) 多重檢測：使用不同顏色的熒光團(tuán)同時檢測同一張載玻片上的兩種或多種目標(biāo)蛋白。(ii)靈敏度：近紅外檢測幾乎消除了背景信號，因此與可見熒光檢測相比，信噪比提高了 4 倍。它還可以在沒有信號放大系統(tǒng)的情況下檢測弱表達(dá)的蛋白質(zhì)。 (iii) 動態(tài)范圍：通過使用適當(dāng)?shù)臋z測器（例如光電倍增管 PMT），可以提高靈敏度和動態(tài)范圍。在這里，我們已經(jīng)證明，通過使用 InnoScan 710-IR 的 XDR 掃描模式，RPPA 實驗成本顯著降低，從而使 RPPA 適合對大型隊列中的生物標(biāo)志物進(jìn)行精確分析。