環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術原理淺析
01 DNA及其擴增的幾個基本規(guī)則
1.DNA雙鏈的互補性與方向性：
自然界的大多數DNA都以雙鏈形式存在：正負配對，就像一對磁鐵。而且正負鏈的方向相反，一個從左往右，一個從右往左。DNA鏈的序列稱為一級結構，正負鏈之間會形成很多氫鍵（虛線）來穩(wěn)定結構，形成“二級結構”。而圖2中的DNA單鏈自身就會通過序列互補形成“啞鈴”型的二級結構。
圖1：DNA雙鏈和正負鏈通過氫鍵（虛線）結合，1234都是鏈中任意的序列
圖2：DNA一級序列通過互補配對形成二級結構
2.DNA擴增需要“引物”，且只能延一個方向擴增：
引物是人工合成的可以和長DNA鏈互補的短序列，目的是實現(xiàn)DNA的擴增。DNA擴增的這種特性主要由DNA聚合酶決定。DNA聚合酶——無論是PCR中的Taq酶，還是LAMP中的Bst酶，都需要識別引物來開始序列擴增。引物的末端有暴露的-OH羥基，是DNA聚合酶的結合位點之一。聚合酶會在引物后端按照模板互補擴增，直至無鏈可擴。為了方便起見，本文中所有結合了DNA聚合酶并且可以擴增的唯一方向都用紅色箭頭表示，且當擴增結束時，紅色箭頭會變?yōu)槠胀ǖ哪┒耍荒芾^續(xù)延伸。
圖3 引物、DNA聚合酶和擴增方向（√符號示意）
3.Bst DNA聚合酶的“鏈置換活性”：
氫鍵是一種可強可弱的相互作用力，在高溫時會斷開，降溫時會穩(wěn)定，而LAMP的反應溫度則處于兩者之間（65℃），因此LAMP反應中的氫鍵理論上處于一種動態(tài)平衡的狀態(tài)。LAMP中使用的Bst DNA聚合酶具有很強的“鏈置換活性”，兩條鏈之間氫鍵可能會在斷開后立馬和其它鏈形成新的氫鍵（圖4）
圖4 Bst聚合酶的鏈置換活性
02“啞鈴型”核酸結構開始的LAMP擴增
2.1臨床檢查
現(xiàn)在我們就可以來看看LAMP是如何通過巧妙的設計來完成等溫擴增。與大多數敘述LAMP的文章不同，本文直接從LAMP擴增最關鍵的“啞鈴型”核酸入手，將它作為起點，來分解LAMP的擴增原理。筆者自制了反應過程中的中間結構（.5與.75結構）以幫助理解。
這個“啞鈴型”核酸就是剛才見過的自帶雙環(huán)結構的DNA，它的兩端可以自身配對，這種結構恰恰就自帶引物結構，提供擴增的起始位點（圖5）。
圖5 啞鈴型核酸以自身為模板的擴增（1）→（2）
LAMP中并不是沒有引物，但它的引物有雙重作用，其中之一就是與結構（2）中存在的單環(huán)結合完成擴增形成結構（3）（圖6）。
圖6 結構（2）→（3）：（2.5）隨著下方鏈的擴增、上方的鏈會逐漸解離，
并在解離完成后自身形成環(huán)結構
結構（3）自身又自帶引物，可以擴增為結構（4）（圖7）。在結構（4）產生的同時，也會釋放出一條結構（4*），它也是可以形成啞鈴型結構核酸分子，從而可以同步獨立完成從結構（1）~結構（4）的擴增。
圖7 結構（3）→（4），并形成一個新的啞鈴結構分子
結構（4）上的單環(huán)又可以和體系中的另一個引物結合，形成結構（5）（圖8）。以此類推，之后的結構會變得較為復雜，感興趣的朋友可以參考T. Notomi等人發(fā)表的原文獻插圖。相信有本文的引導，看懂他們的插圖應該不成問題。
啞鈴型結構的DNA每進行3次擴增就會額外形成一個新的啞鈴型結構，且原結構會繼續(xù)延長，最后形成若干首尾相連的“菜花型”結構，并在此過程中同時產生新的可以獨立擴增的額外模板，目標DNA會指數擴增到檢測限。
由此可見，LAMP擴增的最終產物是一堆長短不一的混合物，這注定了LAMP只能用于檢測，而不能用于基因克隆。但LAMP擴增使用到4~6個引物，大大增加了擴增的特異性。更多的應用可以在環(huán)介導等溫擴增（LAMP）簡介一文中閱讀。
圖8 結構（4）→（5）
圖9 任意DNA序列+引物→啞鈴型結構
附：可使用到的耐思產品
PCR管
移液槍頭
