什么是多重PCR？

多重PCR(multiplex Polymerase Chain Reaction，mPCR)也稱復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系中加入一對以上引物，各對引物分別結(jié)合在模板相對應(yīng)位置，最終擴增出一條以上目的DNA片段(圖1)，其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同。
 

▲ 圖1:多重PCR反應(yīng)示意圖（圖源網(wǎng)絡(luò)，侵刪）
 

熒光定量PCR可以實現(xiàn)多重PCR嗎？

當然是可以的，熒光定量PCR除了常規(guī)的單基因定量外，也是可以實現(xiàn)多個基因的同時檢測。單基因檢測我們一般使用染料法，通過染料分子與雙鏈DNA的結(jié)合來進行PCR反應(yīng)的實時監(jiān)測，但是這種結(jié)合是非特異的，我們無法區(qū)分同一個PCR反應(yīng)體系中的多個目的DNA片段，因此需要采用另一種方式來同時進行多基因的檢測，也就是探針法。
 

▲ 圖2:染料法和探針法的檢測原理（圖源網(wǎng)絡(luò)，侵刪）

探針法通過與模板特異性結(jié)合的探針解決了特異性的問題，同時不同的探針可以標記不同的熒光基團，通過對不同探針之間的識別，從而實現(xiàn)對多個基因的同時檢測和定量。但是這又帶來一個問題，就是在針對不同基因設(shè)計探針時該如何選擇熒光基團呢？

在選擇熒光基團時首先要考慮一個問題，您要使用的儀器所配置的熒光通道是怎樣的，這里就以Azure Cielo™ 6實時熒光定量PCR系統(tǒng)和Stilla naica^® 6色微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)為例來進行說明。

▲ 圖:多重檢測示意圖（圖源網(wǎng)絡(luò)，侵刪）
 

Azure Cielo™ 6實時熒光定量PCR系統(tǒng)共有6個熒光通道，最多可同時檢測6個基因。為什么能同時檢測這么多基因呢，這里就要科普一個小知識了，那就是熒光是怎么產(chǎn)生的。當激發(fā)光照射到熒光基團上時，熒光基團就會發(fā)出發(fā)射光，也就是我們需要的熒光信號，對于不同的熒光基團，其接收的激發(fā)光和發(fā)射的發(fā)射光波長都是不一樣的，因此需要根據(jù)機器的特性進行選擇。對于Azure Cielo™ 6實時熒光定量PCR系統(tǒng)，只要使用的熒光基團在6個通道的激發(fā)和發(fā)射波長的范圍內(nèi)，都支持使用。其次，Azure Cielo™ 6實時熒光定量PCR系統(tǒng)的熒光檢測通道的設(shè)計之初，就是要覆蓋市面上大多數(shù)的熒光基團類型，所以基本不需要擔心探針適配性問題。
 

▲ 圖4:Azure Cielo™ 6實時熒光定量PCR系統(tǒng)的熒光檢測通道
 

naica^® 6色微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)熒光探針的選擇與Azure Cielo™ 6相似，對于naica^® 6色微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)而言，其同樣配置有6個熒光檢測通道，6個通道的波長范圍也基本覆蓋了市面上大部分的熒光基團，無需擔心適配性和選擇問題。
 

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法國Stilla Technologies公司naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質(zhì)控，3小時內(nèi)即可獲得至少6個靶標基因的絕對拷貝數(shù)濃度。