ATF的補(bǔ)料分批/灌流混合工藝在病毒疫苗生產(chǎn)的應(yīng)用

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使用基于ATF的補(bǔ)料分批/灌流混合工藝進(jìn)行病毒疫苗生產(chǎn)

來(lái)自德國(guó)馬克斯·普朗克復(fù)雜技術(shù)系統(tǒng)動(dòng)力學(xué)研究所和ProBioGen AG等的科學(xué)家們?cè)?019年第103期的《Applied Microbiology and Biotechnology》雜志上發(fā)表了題為“High titer MVA and influenza A virus production using a hybrid fed-batch/perfusion with an ATF system”的文章。文中，研究人員提出了一種在高細(xì)胞密度工藝中提高M(jìn)VA（修飾的安卡拉痘苗病毒）產(chǎn)率的培養(yǎng)策略。該策略基于此前研究人員在搖瓶培養(yǎng)中開(kāi)發(fā)的方法，在臺(tái)式生物反應(yīng)器中建立，包括AGE1.CR.plX細(xì)胞在化學(xué)限定培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)至高細(xì)胞密度，然后以MVA-CR19病毒株感染。首先，建立灌流策略，以?xún)?yōu)化細(xì)胞生長(zhǎng)階段。其次，初始感染階段選擇補(bǔ)料分批策略，以促進(jìn)病毒攝入和細(xì)胞間的傳播。最后，再切換為灌流，為病毒增殖晚期連續(xù)提供營(yíng)養(yǎng)物。該補(bǔ)料分批/灌流混合策略獲得最大感染性滴度為1.0 x 10^10 IU/mL，相比傳統(tǒng)批次培養(yǎng)，產(chǎn)物滴度可提高一個(gè)數(shù)量級(jí)。最后，從生產(chǎn)滅活疫苗考慮，將該策略用于生產(chǎn)流感A/PR/8/3（H1N1）病毒，使用相同的培養(yǎng)系統(tǒng)，可達(dá)到3.8 × 10^10 virions/mL的總數(shù)。總體來(lái)講，使用相同的系統(tǒng)，可獲得與傳統(tǒng)批次培養(yǎng)相當(dāng)或更高的細(xì)胞特異性病毒產(chǎn)量和單位體積產(chǎn)率。此外，大多數(shù)病毒顆粒在培養(yǎng)上清中，可簡(jiǎn)化下游操作，特別是MVA病毒。研究人員總結(jié)認(rèn)為該策略有助于新的病毒疫苗生產(chǎn)方法的開(kāi)發(fā)。

實(shí)驗(yàn)：生物反應(yīng)器培養(yǎng)

CR.pIX細(xì)胞以0.8-10^6cells/mL的密度接種1L 臺(tái)式生物反應(yīng)器，工作體積0.6-0.8L。生物反應(yīng)器操作條件設(shè)置為37℃、pH 7.2、攪拌速度 120-160rpm，以20μm微泡控制DO為40%。細(xì)胞開(kāi)始以批次模式培養(yǎng)，當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到14-17mM時(shí)（接種后60-72h），開(kāi)始灌流。灌流使用XCell ATF 2系統(tǒng)，以C24控制器控制，流速設(shè)置為1.0L/min，并以確定的灌流速率進(jìn)行操作，以達(dá)到＞25 x 10^6cells/mL的細(xì)胞密度。

在細(xì)胞生長(zhǎng)階段，灌流速率每12或24h手動(dòng)調(diào)節(jié)。操作時(shí)，離線(xiàn)檢測(cè)活細(xì)胞密度，計(jì)算取樣時(shí)間點(diǎn)的相應(yīng)流速，確保CSPR為0.06nL/cell/day，這是CR.pIX細(xì)胞基于其葡萄糖消耗速率的最佳置換速率。根據(jù)最高細(xì)胞特異性生長(zhǎng)速率μ=0.026h-1，計(jì)算12或24h后的預(yù)期活細(xì)胞密度和相應(yīng)的灌流速率。使用BIOSTAT B plus模塊的級(jí)聯(lián)控制，可獲得采樣時(shí)間點(diǎn)之間的線(xiàn)性曲線(xiàn)。感染前2h，使用ATF系統(tǒng)，以新鮮培養(yǎng)基置換1個(gè)反應(yīng)器體積。

培養(yǎng)置換后，生物反應(yīng)器感染MVA-C19或流感A病毒A/PR/8/34（H1N1）。對(duì)于MVA-CR19病毒，使用2種補(bǔ)液程序加上灌流程序，命名為混合工藝1和混合工藝2，以?xún)?yōu)化在高細(xì)胞密度條件下的病毒增殖。對(duì)于混合工藝1，廢棄部分細(xì)胞懸液，以0.3L的細(xì)胞懸液開(kāi)始病毒生產(chǎn)階段。病毒感染后，加入0.15L新鮮培養(yǎng)基，立即開(kāi)始補(bǔ)料分批，在感染后12h再補(bǔ)液0.15L，感染后24小時(shí)，補(bǔ)液0.3L。最后，在感染后36-120h，以1vvd的速率進(jìn)行灌流。病毒顆粒（200-400 nm）使用與細(xì)胞生長(zhǎng)階段相同的ATF中空纖維組件進(jìn)行收獲。相似的，對(duì)于混合工藝2，在病毒感染后立即補(bǔ)液0.2L，之后在感染后24h，補(bǔ)液0.25L，最后，在感染后36-120h，以1vvd的速率進(jìn)行灌流。為提高病毒收獲，在感染后36小時(shí)，將細(xì)胞生長(zhǎng)階段使用的0.2μm中空纖維組件替換為新的更大孔徑組件。對(duì)于流感病毒A生產(chǎn)，評(píng)估了一種與MVA-CR19病毒相似的混合策略。

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原文：D.Vazquez-Ramirez, I.Jordan, V.Sandig, High titer MVA and influenza A virus production using a hybrid fed-batch/perfusion with an ATF system. Applied Microbiology and Biotechnology, 2019, 103: 3025-3035.