簡介

在體內，細胞存在于富含I型膠原蛋白的三維細胞外基質環(huán)境內，所以三維基質是天然的組織工程學支架。水凝膠因具有與多數(shù)組織天然細胞外基質相似的結構和良好的生物相容性，故而被作為工程組織支架的首選。

I型膠原蛋白廣泛存在于自然界，在大部分的結締組織中，是主要的細胞外基質成分，其具有典型的層級結構。多肽鏈的一級結構由重復的（Gly-X-Y）n組成，每三位由甘氨酸占據(jù)，X通常為脯氨酸，Y為羥基脯氨酸。3個α鏈交織形成3螺旋，進一步形成纖維絲和纖維。整個結構由分子間的氫鍵和共價鍵以及側鏈氨基酸殘基間的離子、疏水及靜電作用力穩(wěn)定。

基于膠原蛋白的材料已在醫(yī)學領域應用多年，其優(yōu)勢包括良好的生物相容性、無毒性、無抗原性和可生物降解等。膠原蛋白支架可用作細胞粘附、增殖和分化的底物，也可通過體外重建形成微纖維結構，模擬天然細胞外基質，所以其被認為是理想的組織工程學材料。

膠原蛋白生物材料通常需要一定程度的交聯(lián)，以穩(wěn)定結構�；瘜W交聯(lián)可將多肽鏈交聯(lián)形成網狀，常用的交聯(lián)劑包括戊二醛、EDC、N-羥基琥珀酰亞胺、異氰酸酯、單寧酸等。此外，光化學交聯(lián)也是常用的方法。酶也可用于交聯(lián)，如轉谷氨酰胺酶可選擇性介導相鄰蛋白纖維上谷氨酸鹽和賴氨酸的化學反應，形成共價酰胺結合，增強3D基質。生物聚合物也可通過非共價交聯(lián)鍵穩(wěn)定，如殼聚糖氨基基團和膠原蛋白羧基基團間形成的離子鍵。

膠原蛋白溶液合適的pH可促進蛋白鏈之間離子反應的發(fā)生，膠原蛋白在酸性pH條件下可溶，所以，在此條件下，膠原蛋白不能形成有序的層級結構。所以對膠原蛋白進行中和是制備凝膠的一種方法。在合適的條件下，中和過程伴隨著膠原蛋白分子聚集并排列形成細纖維。在此過程中，添加化學試劑可優(yōu)化最終材料的物理、化學和機械特性，但也可能影響其生物學特性和細胞粘附能力。本實驗使用透析法作為中和膠原蛋白溶液的方法，以減少制備過程中化學試劑的使用數(shù)量。

實驗

膠原蛋白從年輕白鼠尾部肌腱中分離。肌腱從粘附組織上刮離，用去離子水漂洗，置于8℃ 0.1M 醋酸中72h。離心去除雜質和不溶性成分。然后將膠原蛋白溶液凍干。

制備1%膠原蛋白-醋酸溶液（起始pH=2.9），置于12-14kD Spectra/Por 再生纖維素透析袋內。為確定最佳處理條件，分別使用3種透析液：水（pH=7）、0.1M NaOH （pH=13）以及10% NaCl（pH=7），體積為透析樣品12倍。透析于6℃進行，連續(xù)攪拌，每12h更換透析液，以控制pH值。透析進行7天后結束，此時透析液的pH值不再發(fā)生變化，說明膠原蛋白溶液的pH已與周圍透析液一致。

由于某些分析技術要求在無水條件下進行，所以制備的材料采用空氣干燥或凍干。透析制備的膠原蛋白凝膠置于聚乙烯薄片上空氣干燥3天（干燥膠原蛋白），以進行FTIR-ATR、熱分析和接觸角檢測。三類樣品凍干后（凍干膠原蛋白）檢測：直徑16mm/長10mm的膠原蛋白用于SEM成像檢測、直徑16mm/1mm厚的膠原蛋白用于體外測試、40mm長/2mm厚/5mm寬的膠原蛋白用于機械分析。

此外，為比較中性膠原蛋白和酸性膠原蛋白，制備了酸性膠原蛋白薄膜，即將1%膠原蛋白-醋酸溶液倒于聚乙烯薄片上，空氣干燥。

結果和討論

以不同溶液透析獲得的材料存在顯著差異：0.1M NaOH透析獲得的材料透明，但為半流體，不能維持其性狀；10% NaCl透析獲得的材料為白色、相對柔軟的凝膠；而以純水透析獲得的材料透明、性狀保持良好、耐受一定的壓力、具有彈性，且在37℃孵育24后，仍可保持穩(wěn)定結構。干燥后的中性膠原蛋白凝膠形成相對堅硬、多孔的海綿結構。SEM成像分析可觀察到材料內部孔壁表面的纖維樣突出，說明膠原蛋白鏈在透析過程中具有自組織能力，且紅外光譜分析也證實中性膠原蛋白結構更有序，且含有大量的三螺旋結構。對中性膠原蛋白的熱降解分析顯示，其具有較高的降解溫度，說明其更穩(wěn)定。對中性膠原蛋白的抗張強度測試也表明，其內部膠原蛋白鏈存在多種交互，穩(wěn)定了蛋白組織結構。凍干/干燥中性膠原蛋白具有較強的膨脹系數(shù)。此外，對膠原蛋白材料的體外生物學測試顯示，細胞可耐受中性膠原蛋白。

實驗結果證明，通過透析工藝，可制備穩(wěn)定、透明的膠原蛋白水凝膠，不溶于水和PBS緩沖液，且可顯著膨脹。改變膠原蛋白溶液的pH值，可獲得更有序的結構，與天然膠原蛋白的三螺旋相近，且相比酸性膠原蛋白薄膜，材料的熱穩(wěn)定性更出色。凝膠凍干后，可獲得多孔、立體、形狀穩(wěn)定的材料，材料適于細胞生長，但由于材料表面無孔，細胞不會遷移進入支架內部結構。

透析中和法還可用于制備膠原蛋白和其它蛋白混合的水凝膠，如彈性蛋白以及糖胺聚糖。這些混合物為聚合電解質，所以離子及靜電反應可在分子間發(fā)生，從而改變膠原蛋白的結構。不同大分子的添加可對水凝膠形成正面或負面的影響，但添加量不應過多，以避免改變水凝膠的穩(wěn)定性，而且分子量應足夠大，以防止在透析過程中通過膜孔而損失。

編者出于交流目的編譯、介紹此文，由于水平有限，如有不當之處，敬請諒解，詳細內容，請參考原文。

原文：Skopinska-Wisniewska J., Olszewski K., Bajek A., et al., Dialysis as a method of obtaining neutral collagen gels. Material Science and Engineering C, 2014, 40: 65-70.
 

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