對于一個完美的westernblot實(shí)驗(yàn)，蛋白在聚丙烯凝膠中根據(jù)天然分子量進(jìn)行分離，蛋白被很好的從凝膠上轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后通過特異性的抗體進(jìn)行免疫檢測。

對于轉(zhuǎn)印來說，使用濕轉(zhuǎn)的方法是比較好的，因?yàn)槟�膠和膜都能夠完全浸沒在轉(zhuǎn)印buffer中，在半干轉(zhuǎn)的條件下，轉(zhuǎn)印是在兩個電極板之間發(fā)生，這種類型的轉(zhuǎn)印裝置可能影響蛋白的轉(zhuǎn)印效率和膜上的截留能力。對于優(yōu)化蛋白的轉(zhuǎn)印條件，每個系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)都應(yīng)該考慮進(jìn)去。

濕轉(zhuǎn)

對于一個濕轉(zhuǎn)過程，要建立一個三明治結(jié)構(gòu)，順序?yàn)楹＞d，濾紙，膜，膠，濾紙，和第二個海綿。在組裝之前，需要將所有部分（包括膠）放在轉(zhuǎn)印buffer中進(jìn)行平衡，然后將堆疊的三明治結(jié)構(gòu)用轉(zhuǎn)印夾夾起來放在轉(zhuǎn)印裝置上，連上電極裝置，蛋白在轉(zhuǎn)印buffer中從膠上轉(zhuǎn)移到膜上。大多數(shù)western blot實(shí)驗(yàn)應(yīng)用都可以使用濕轉(zhuǎn)。

半干轉(zhuǎn)

對于半干轉(zhuǎn)來說，也需要進(jìn)行堆疊組裝（濾紙，膠，膜需要放在轉(zhuǎn)印buffer中進(jìn)行預(yù)平衡）放在裝置電極板的底部，蓋上上極板，高強(qiáng)的電流通過三明治結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)印速度較快，一般小于1h。

轉(zhuǎn)印的注意事項(xiàng)

1.當(dāng)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)印buffer時一定要注意：小組分的不一致都可能影響轉(zhuǎn)印

2.使用高質(zhì)量，純度高的甲醇溶液，如果甲醇質(zhì)量不佳，會影響轉(zhuǎn)膜的效率

3.不要稀釋轉(zhuǎn)印buffer

4.不要調(diào)整轉(zhuǎn)印buffer的PH值

5.為了得到最佳的轉(zhuǎn)印，buffer要使用新的

6.裝置保持干凈

7.使用一定厚度的膠（0.5-0.75）

8.如果使用PVDF膜，膜在轉(zhuǎn)印之前需要在100%甲醇中進(jìn)行浸泡

9.轉(zhuǎn)印墊，濾紙，膠和膜需要在轉(zhuǎn)印buffer中平衡至少15min

10.在轉(zhuǎn)印的時候要將膜和膠之間的空泡趕走

11.確定電極是連接正確，避免不必要的損失

12.使用預(yù)染的分子量marker，來監(jiān)控轉(zhuǎn)印

13.對于難轉(zhuǎn)印的蛋白，可以調(diào)整甲醇和SDS的濃度，SDS能夠提升蛋白從膠上的遷移而抑制與膜的結(jié)合。甲醇能夠促進(jìn)蛋白和膜的結(jié)合，但是阻礙蛋白從膠上的遷移。