雜質(zhì)分析對于藥物的研發(fā)至關重要1。在研究過程中，雜質(zhì)譜信息能幫助藥物化學家優(yōu)化合成路線和避免潛在的有毒雜質(zhì)。在開發(fā)過程中，當大量母體化合物存在時，鑒定和表征痕量雜質(zhì)至關重要，從而促進了高分辨率、高靈敏度和高掃描速度的HR-MS 儀器和智能化結(jié)構鑒定軟件的發(fā)展。

 

為了展示HR-MS 在雜質(zhì)分析和結(jié)構鑒定方面的能力，本文選用了市售藥物奧美拉唑。本研究采用了賽默飛世爾科技的Q Exactive 臺式Orbitrap 質(zhì)譜儀和數(shù)據(jù)處理軟件Mass Frontier 來快速分析和鑒定奧美拉唑中雜質(zhì)的結(jié)構。

 

奧美拉唑（CAS# 73590-58-6）購自Sigma-Aldrich，產(chǎn)品號O104-100MG。

乙腈和水來自Fisher Scientific

乙酸銨購自Sigma-Aldrich，產(chǎn)品號73594-25G-F。

甲酸購自Sigma-Aldrich，產(chǎn)品號33015-500ml。

 

奧美拉唑溶液（0.5 mg/mL）配制在1:1 乙腈/ 水混合溶劑中。

 

色譜分離采用Ultimate3000 UHPLC 系統(tǒng)。

色譜柱：Hypersil GOLD 柱，2.1mm×150mm，粒徑3 μm.

柱溫：35 ℃，流速：0.5 mL/min，進樣體積：8 μL

流動相：A - 水；B - 乙腈；C -100 mM 乙酸銨，用乙酸調(diào)節(jié)pH 值到5

 

 

梯度洗脫：

 

質(zhì)譜分析采用 Q Exactive 質(zhì)譜儀的電噴霧正離子模式。在70,000 和 35,000 分辨率FWHM@m/z 200 下分別采集高分辨全掃描一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)依賴Top3 二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

 

離子源條件：

離子化模式：正離子ESI

離子源：HESI-II

鞘氣流速：45 單位N2

輔助氣流速：10 單位N2

噴霧電壓（KV）：+3.5

毛細管柱溫度（℃）：320

S-lens RF 水平：50.0

加熱器溫度（℃）：400

 

Q Exactive 方法參數(shù)：

AGC 目標（全掃描）：3e6

AGC 目標（MS/MS）：1e5

NCE：30，35% 階梯變化

掃描范圍（全掃描MS）：180 到1200 amu

 

采集得到奧美拉唑的高分辨率全掃描和三個最高強度的數(shù)據(jù)依賴HCD MS/MS 數(shù)據(jù)。HRAM 全掃描和MS/MS 數(shù)據(jù)提供了分子量和碎片信息。HCD（高能量碰撞解離）得到了豐富的MS/MS 碎片和低質(zhì)量端碎片信息。利用Mass Frontier 軟件與這些信息互相配合，我們不僅快速檢測出奧美拉唑的主要雜質(zhì)，而且可靠地測定了相應的元素組成，如圖1&2 和表1 所示。

 

圖1. 奧美拉唑的質(zhì)譜總離子流圖

 

 

圖2. 奧美拉唑的高分辨率準確質(zhì)量數(shù)全掃描和MS/MS 譜圖

 

 

圖3. Mass Frontier 的FISh 功能鑒定雜質(zhì)

 

表1. 已識別雜質(zhì)的準確質(zhì)量數(shù)和元素組成

 

 

采用Mass Frontier 的“ 碎片離子搜索”（FISh） 功能處理HRAM 全掃描和MS/MS 數(shù)據(jù)， 見圖3-a。FISh 能輕易識別出與母體化合物具有相同碎片離子的化合物，見圖3-b，并根據(jù)碎片推斷出可能的雜質(zhì)結(jié)構，見圖7。通過搜索Mass Frontier 的HighChem 譜圖數(shù)據(jù)庫，Mass Frontier的“Fragment and Mechanism（碎片和機理）”功能可以提供推薦結(jié)構的參考文獻。每個推薦結(jié)構的“Fragment andMechanism”結(jié)果對于理解結(jié)構來源提供了很好的幫助。將數(shù)據(jù)結(jié)果與“Fragment and Mechanism”進行比較，為推薦結(jié)構提供了更多的確認/ 否定標準。

 

Mass Frontier 的另一個重要特色是“碎片結(jié)構的注解圖譜”，用于碎片的自動預測。三個同分異構體的結(jié)構鑒定演示了這個功能，見圖4 和5。

 

 

圖4. m/z 為376.1331 的雜質(zhì)的三個同分異構體

 

 

圖5-a. RT 8.1 min 的m/z 為376.1331 的雜質(zhì)的MS/MS 譜圖

 

 

圖5-b. RT 8.5 min 的m/z 為376.1331 的雜質(zhì)的MS/MS 譜圖

 

 

圖5- c. RT 11.2 min 的m/z 為376.1331 的雜質(zhì)的MS/MS 譜圖

 

 

*9’和10’是9 和10 的同分異構體。

圖7. 奧美拉唑雜質(zhì)的推薦結(jié)構

 

Q Exactive 臺式Orbitrap 系統(tǒng)能實現(xiàn)全掃描和MS/MS 數(shù)據(jù)的高分辨率準確質(zhì)量數(shù)測定（HRAM），為未知雜質(zhì)的結(jié)構鑒定提供至關重要的分子量和結(jié)構信息：HRAM 全掃描準確測定元素組成，而HRAM MS/MS 能準確測定雜質(zhì)成分。

 

Mass Frontier 碎片離子搜索（FISh） 和“Fragment and Mechanism”功能，通過搜索HighChem 碎片數(shù)據(jù)庫準確鑒定未知物的結(jié)構。

 

由Q Exactive HRAM 數(shù)據(jù)和Mass Frontier 軟件組成的工作流程能幫助研究人員在藥物研究的早期高效準確地鑒定每批次API 中的雜質(zhì)。

 

1.FDD Guidance for Industry, Q3A (R2) Impurities in New Drug Substances