介紹

這篇博客文章的目的是為Simoa®用戶提供有效的資源，用于檢測(cè)下限（LOD）和定量下限（LLOQ）的常見(jiàn)分析驗(yàn)證。確定檢測(cè)和定量下限的方法在復(fù)雜性上有所不同，這取決于測(cè)定開(kāi)發(fā)階段和適用的法規(guī)。例如，在早期開(kāi)發(fā)中，通過(guò)簡(jiǎn)單地插值校準(zhǔn)曲線來(lái)近似LOD可能就足夠了，但對(duì)于最終驗(yàn)證，可能需要使用真實(shí)樣本進(jìn)行更深入的實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)方法。

指導(dǎo)方針

臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI）專門為診斷免疫測(cè)定驗(yàn)證提供了一些最具參考價(jià)值的指南。這些指南發(fā)表在一系列文件中，如CLSI EP17——臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)量程序檢測(cè)能力評(píng)估，第2版。除了CLSI指南外，歐洲藥品管理局在其ICH Q2（R2）分析程序驗(yàn)證——科學(xué)指南文件中提供了另一套有價(jià)值的指南，用于驗(yàn)證各種分析方法，不限于免疫測(cè)定。本指南主要側(cè)重于藥品質(zhì)量控制中使用的分析方法。

檢測(cè)極限和定量極限的估計(jì)

CLSI指南使用三種檢測(cè)質(zhì)量屬性來(lái)接近檢測(cè)能力：空白限度（Limit of Blank LOB）、檢測(cè)限度（Limit of Detection LOD）和定量限度（ Limit of Quantitation LOQ）。

LOB：當(dāng)對(duì)不含分析物的樣品進(jìn)行重復(fù)測(cè)試時(shí)，預(yù)計(jì)會(huì)發(fā)現(xiàn)的最高表觀分析物濃度。

LOD：可與LOB可靠區(qū)分的最低分析物濃度，在該濃度下檢測(cè)是可行的。

LOQ：分析物不僅可以可靠檢測(cè)，而且可以達(dá)到某些預(yù)定義目標(biāo)（即精度和偏差）的最低濃度。

高靈敏度測(cè)定的特征在于低LOD；然而，低LOB也是實(shí)現(xiàn)低LOD所必需的。在任何免疫測(cè)定中，由于非特異性結(jié)合（例如，檢測(cè)抗體與捕獲表面和/或抗體之間的弱相互作用），都會(huì)有固有的背景信號(hào)，但可以采取步驟將其最小化。在Simoa®開(kāi)發(fā)Homebrew時(shí)，我們通常建議將空白信號(hào)的目標(biāo)定為每珠平均酶數(shù)0.005–0.05（AEB）。然而，了解空白樣品和低濃度樣品的可變性是評(píng)估測(cè)定檢測(cè)能力的關(guān)鍵。根據(jù)CLSI EP17指南，含有LOD分析物的樣品應(yīng)在95%的時(shí)間內(nèi)與LOB區(qū)分開(kāi)來(lái)。

設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以評(píng)估檢測(cè)限時(shí)要考慮的變量包括要測(cè)試的試劑盒批次數(shù)量、操作員數(shù)量（如果使用手動(dòng)步驟的儀器，如SR-X）、天數(shù)（分析批間變異性）、要測(cè)試的不同空白樣品/低濃度樣品數(shù)量，以及要測(cè)試的空白/低濃度樣本的總重復(fù)次數(shù)。根據(jù)定義，LLOQ必須等于或大于LOD。LLOQ的確定與LOD的不同之處在于，還需要滿足精度和偏差的預(yù)定義目標(biāo)。通常，精密度的目標(biāo)是將產(chǎn)生20%或更低的濃度變異系數(shù)（CV）的最低分析物濃度�？梢允褂酶鞣N方法來(lái)確定LLOQ，Quanterix使用的三種方法在客戶門戶網(wǎng)站上的技術(shù)說(shuō)明中有描述（TECH-0034；定量下限）。4PL方法開(kāi)發(fā)工具（也在客戶門戶網(wǎng)站上）使用一種稱為CV分析的方法，根據(jù)校準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)估計(jì)LLOQ。電子表格不是為用戶設(shè)計(jì)的驗(yàn)證工具（因此計(jì)算是隱藏/鎖定的），但它可以是早期分析開(kāi)發(fā)中的有用工具，也可以用來(lái)表征正在開(kāi)發(fā)或測(cè)試的分析的性能。