作為免疫系統(tǒng)的第一反應者，自然殺傷細胞(NK)對于快速檢測和消除癌癥至關重要。它們在沒有事先致敏的情況下殺死癌細胞的能力使它們成為理想的免疫治療的候選者。當激活受體(如CD16)與單克隆抗體結合在靶細胞上時，NK細胞會誘導一種被稱為抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)的抗腫瘤免疫反應。將過繼NK細胞與單克隆抗體結合輸注是治療癌癥的一種有潛力的策略。

達雷木單抗(Daratumumab，DARA)是一種與CD38結合的單抗，在治療多發(fā)性骨髓瘤方面顯示具臨床療效，使其成為增強NK細胞輸注的一個有吸引力的候選藥物。然而，由于循環(huán)NK細胞表達高水平的CD38, DARA可導致ADCC依賴的NK自相殘殺，限制了這種組合療法的療效。結合DARA和過繼轉移CD38基因敲除的NK細胞具有最大化ADCC并阻止DARA誘導的自相殘殺的潛力，增強NK細胞持久性。為了進一步增強它們的功效，NK細胞可以被改造成表達高親和CD16 (CD16-158V)受體，該受體已被證明可以促進ADCC，從而改善臨床結果。

在這里，我們展示了MaxCyte®如何在NK細胞中啟用多重基因工程。雙編輯NK細胞改善了DARA治療，增強了體外和體內的抗腫瘤反應。MaxCyte電穿孔技術提供了包括高效率、低毒和臨床可擴展性在內的顯著優(yōu)勢，使一種有效的癌癥治療方法得以快速發(fā)展。
 
來自Childs實驗室的這項令人興奮的研究使用了互補的基因工程策略來產生具有增強ADCC效力的NK細胞，且在DARA存在下不自相殘殺。這些實驗表明，MaxCyte電穿孔對細胞活力和功能的影響很小，是一個安全的平臺，可以幫助開發(fā)基于細胞的癌癥治療方法。
 
 
方法

•  從健康供體外周血灰黃層細胞中獲取NK細胞。
• 體外擴增分離NK細胞一周。NK細胞與輻照的Epstein–Barr病毒轉化的淋巴母細胞飼養(yǎng)細胞和IL-2共培養(yǎng)。
• 使用MaxCyte ATx®和NK-04電穿孔方案將預絡合的Cas9和靶向CD38的gRNA遞送到擴增的NK細胞。CD16-158V的敲入(KI)通過兩種不同的途徑完成:電穿孔或AAV轉導。
• CD16的瞬時表達ATx®用于傳遞CD16-158V mRNA在第一次電穿孔7天后轉染到CD38KONK細胞中，產生瞬時雙編輯NK細胞。
• 穩(wěn)定CD16KI重組腺相關病毒(rAAV6)，含有編碼CD16-158V基因的HDR模板，在初始電穿孔30分鐘后，將N端FLAG標簽添加到CD38KONK細胞中。轉導產生穩(wěn)定CD16-158V在CD38位點的轉基因整合.
• 分離工程細胞，采用PCR和流式細胞術對其進行鑒定。分離的NK細胞的功能通過體外殺傷實驗和小鼠體內多發(fā)性骨髓瘤模型測定。

結果
高效基因敲除
 
　　MaxCyte®能夠在92%的擴增NK細胞中有效敲除CD38(圖1A)。電穿孔對細胞的影響較小，因為轉染后幾天細胞存活率仍然很高(圖1B)。
   
CD38KO NK細胞的表征
基因工程沒有改變NK細胞的增殖或功能特征。未編輯NK細胞和CD38KO NK細胞具有相似的體外擴增率(圖2A)，并且電穿孔后NK表面受體的表達沒有顯著改變(圖2B)。在靶細胞存在的情況下，通過測量溶酶體相關膜蛋白-1(CD107a)在NK細胞上的表達來確定脫粒，并且在CD38KO和CD38WT細胞中相似(圖2C)。此外，NK細胞的細胞毒性在未編輯和工程NK細胞之間具有可比性，這是通過靶細胞存在下細胞內IFN-γ(圖2D)和TNF-α(圖2E)的產生來確定的。
 
電穿孔后NK細胞的增殖和功能特征保持不變。A)電穿孔后14天CD38KO和CD38WTNK細胞擴增。B-E)用流式細胞術檢測CD38KO和CD38WTNK細胞與靶細胞(K562或Raji細胞)共培養(yǎng)后標志物的表達。以利妥昔單抗(RITUX)處理的Raji細胞為陽性對照。B)CD38KO和CD38WTNK細胞表面標記物表達。C)通過CD107a表達測定脫粒。D-E)NK細胞毒性通過細胞內INF-γ和TNF-α的表達測定。
 
激活CD38KONK細胞
為了確定加入CD16-158V是否可以增強CD38KONK細胞的效力，我們使用電穿孔將CD16-158V mRNA傳遞到工程細胞中。CD38KONK細胞轉染CD16-158V mRNA與經DARA處理的CD38+NCI-H929骨髓瘤細胞共培養(yǎng)時，顯示出更好的細胞裂解能力(圖3)。MaxCyte電穿孔法證實了CD38KONK細胞表達CD16-158V后可進一步增強效力。
 
　　電穿孔后一天不同的效靶比(E:T)，CD38KONK細胞表達CD16-158V (CD38KO+EP)或不表達CD16-158V存在下，DARA處理的NCI-H929細胞的裂解情況。
 
多重基因工程技術
 通過電穿孔和AAV轉導的結合，實現(xiàn)了穩(wěn)定的多重基因工程。使用CRISPR-Cas9 RNP電穿孔破壞CD38表達，同時重組AAV傳遞編碼CD16-158V的HDR模板。雙編輯CD38KO/CD16KINK細胞的生成通過表面FLAG的表達來確定;58%的CD38KO細胞表達CD16-158V(圖4A)。雙編輯CD38KO/CD16KI NK細胞聯(lián)合DARA誘導多發(fā)性骨髓瘤靶細胞的細胞裂解增加(圖4B)，并顯示MM1.S移植瘤小鼠中腫瘤負荷的最大減少，顯示出優(yōu)越的抗腫瘤活性(圖4C)。MaxCyte的電穿孔技術可以與互補的基因工程工具一起使用，比如AAV，開發(fā)下一代NK細胞療法。 　　
A)在CRISPR-Cas9 RNP電穿孔和AAV轉導7天后測量FLAG陽性NK細胞的百分比。B)雙編輯(CD38KO/CD16KI)、單編輯(CD38KO)和未編輯(CD38WT) NK細胞在MM.1S靶細胞中增強DARA介導的裂解能力的比較。C)雙編輯NK細胞在異種移植小鼠中表現(xiàn)出更高的抗骨髓瘤活性。用于形成腫瘤的MM.1S細胞被慢病毒轉導表達螢火蟲熒光素酶。在30天內測量MM.1S骨髓瘤腫瘤生長的生物發(fā)光定量(光子每秒或總通量)。
 
 
結論及未來應用
高效過繼NK細胞轉移和單克隆抗體聯(lián)合治療是一種很有潛力的癌癥治療策略。MaxCyte的電穿孔技術與AAV轉導相結合，為NK細胞的多重基因工程開發(fā)了一種易于適應的工作流程。利用MaxCyte®電穿孔技術實現(xiàn)的高效率CD38敲除消除了對工程細胞額外富集步驟的需要。此外，隨著時間的推移，CD38表達的減少是穩(wěn)定的，并賦予DARA誘導的NK自相殘殺行為耐藥性。電穿孔不會損害編輯NK細胞的功能或增殖能力。MaxCyte電穿孔也被用來用高親和力CD16-158V修飾CD38KO細胞，增強它們在DARA存在下的細胞毒性。電穿孔和AAV轉導的結合導致了雙編輯NK細胞的高效生產。CD38KO/CD16KI NK細胞在體外和體內均增強了DARA的抗腫瘤活性。MaxCyte為NK細胞的多重工程開發(fā)了一種簡化的工作流程，當與DARA結合時，代表了一種令人興奮的組合免疫治療策略，可以完美地進入臨床。
 

參考文獻
1. Wang Y, Zhang Y, Hughes T, et al. Fratricide of NK Cells in Daratumumab Therapy for Multiple Myeloma Overcome by Ex Vivo-Expanded Autologous NK Cells. Clin Cancer Res. 2018;24(16):4006-4017. doi:10.1158/1078-0432.CCR-17-3117.
 
2. Clara JA, Levy ER, Reger R, Barisic S, Chen L, Cherkasova E, Chakraborty M, Allan DSJ, Childs R. High-affinity CD16 integration into a CRISPR/Cas9-edited CD38 locus augments CD38-directed anti-tumor activity of primary human natural killer cells. J Immunother Cancer. 2022 Feb;10(2):e003804. doi: 10.1136/jitc-2021-003804. PMID: 35135865; PMCID: PMC8830298.
 
關于MaxCyte
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