InnoScan 生物芯片掃描儀在反向蛋白質(zhì)微陣列上的應(yīng)用
概述
本文描述的反相蛋白質(zhì)微陣列 (RPPA) 平臺位于巴黎（法國）居里研究所內(nèi)。 該RPPA 平臺的總體目標(biāo)是通過信號通路分析提供關(guān)于蛋白表達(dá)水平及其活性的生物學(xué)新見解，最終目標(biāo)是改善癌癥患者的治療和療效。該平臺使用高通量自動化設(shè)備（包括 InnoScan 710-IR 掃描儀）對各種類型的微量樣品進(jìn)行個性化蛋白質(zhì)組學(xué)分析。 將介紹 RPPA 技術(shù)的基礎(chǔ)知識，并指出 InnoScan 710-IR 的日常使用如何成為該平臺工作流程的重要組成部分。最后將描述居里研究所進(jìn)行的癌癥研究應(yīng)用案例，以說明 InnoScan 710-IR 的易用性和可靠性。
正文
反相蛋白微陣列 (RPPA) 是一種高通量小型化斑點(diǎn)印跡和基于抗體的技術(shù)（圖 1A），可以分析蛋白表達(dá)水平和信號通路的激活狀態(tài)（通過研究磷酸化或總蛋白表達(dá)）。它結(jié)合了高通量分析和消耗微量樣品的優(yōu)點(diǎn)。事實(shí)上，由于 RPPA 技術(shù)是一種多指標(biāo)檢測技術(shù)，因此可以在同一張覆有硝酸纖維素的載玻片芯片（微陣列）上同時分析多達(dá)一千個樣本。RPPA 工作流程在圖 1，B 中進(jìn)行了描述。使用專用芯片點(diǎn)樣儀，每個樣品和每個點(diǎn)僅打印 1 至 2 ng 的細(xì)胞或組織裂解液。點(diǎn)樣的樣本可以是腫瘤樣本、異種移植物、細(xì)胞系或這些樣本的組合，并以連續(xù)稀釋和復(fù)制的方式系統(tǒng)性地點(diǎn)樣，使該技術(shù)具有高穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)可定量。然后，使用自動染色機(jī)，將微陣列按序與抗體和熒光染料孵育以檢測感興趣的蛋白（圖 1A）：
在居里研究所，RPPA 平臺測試了 2000 多種商業(yè)抗體，并驗(yàn)證了 640 種用于 RPPA 標(biāo)記的一抗，其中近 150 種抗磷酸化蛋白。這組抗體涵蓋了大多數(shù)細(xì)胞信號通路。對于每個項(xiàng)目，研究員從經(jīng)過驗(yàn)證的抗體中選擇感興趣的抗體。 RPPA 平臺不斷評估新抗體，并驗(yàn)證特定抗體以滿足合作者的要求。陽性和陰性對照使用標(biāo)有總蛋白染色 FCF（來自 Grace Biolabs 的方案）標(biāo)記的微陣列作為陽性對照，未標(biāo)記一抗的微陣列作為陰性對照。在量化和數(shù)據(jù)分析之前（圖 1C），用InnoScan 710-IR檢測每個樣品點(diǎn)的紅外熒光。掃描儀有兩個激發(fā)激光：785nm 和 670nm。得益于實(shí)時自動對焦和自動進(jìn)樣器，可以連續(xù)自動掃描 24 張芯片。10µm/像素掃描精度，在 4 分鐘時間內(nèi)完成一張載玻片芯片的掃描。載玻片上的硝酸纖維素在紅色光譜中具有自發(fā)熒光。研究人員選擇使用近紅外熒光來降低硝酸纖維素的背景熒光，提高信噪比。 InnoScan 710-IR 規(guī)格完全符合需提供可靠數(shù)據(jù)的要求，其靈敏度與比色檢測相似，但線性范圍更寬。
圖 1：反相蛋白質(zhì)微陣列工作流程說明。 A. RPPA 的原理，小型化高通量斑點(diǎn)印跡。在使用熒光標(biāo)記抗體檢測蛋白質(zhì)之前，將蛋白質(zhì)打印到硝酸纖維素膜載玻片上。 B. 從蛋白質(zhì)提取到通過 InnoScan 710-IR采集圖像的工作流程。 C. 使用 PARYS 軟件對圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
癌癥研究的應(yīng)用：
該RPPA 平臺參與了多種項(xiàng)目，涵蓋臨床試驗(yàn)評估相關(guān)基本問題，對合作者提供的樣本提供個性化的高通量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，允許：
宮頸癌 (CC)：RAIDs 聯(lián)盟歐洲項(xiàng)目
宮頸癌 (CC) 仍然是女性中第二大最常見的癌癥。大多數(shù)宮頸癌是由高危型人乳頭瘤病毒 (HPV) 的持續(xù)感染引起的。事實(shí)上，它們通過病毒蛋白 E6 和 E7 使正常細(xì)胞控制失效，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定、分子改變的積累、抑癌基因失活和癌基因激活。 RAIDs 歐盟 (EU) 資助的研究在 2013 年至 2017 年間收集了前瞻性宮頸癌樣本（腫瘤和血液）和臨床數(shù)據(jù)集，涉及來自七個歐盟國家 18 個中心的 419 名參與患者。到目前為止，已經(jīng)進(jìn)行了下一代測序（NGS），能夠解析顯性遺傳改變，并且應(yīng)用反相蛋白質(zhì)微陣列（RPPA）研究細(xì)胞信號通路。
居里研究所RPPA 平臺處理了 280 個樣本，包括基線和非基線腫瘤和細(xì)胞系。如前所述（Scholl S, et al., EBioMedicine 2019, PMID: 30952619）進(jìn)行樣品處理（蛋白質(zhì)提取、定量、連續(xù)稀釋、陣列點(diǎn)印、標(biāo)記、掃描、定量和分析）。
采用 194 種特異性一抗對蛋白質(zhì)反向微陣列進(jìn)行檢測。使用 InnoScan 710-IR (INNOPSYS) 掃描了355張載玻片微陣列 ，785 nm波段用于檢測抗體或陰性對照，670nm波段用于檢測陽性對照。
RPPA 蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)的無監(jiān)督聚類揭示了三個患者群，分別為富含 EMT（上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化）、DNA 損傷信號和 MAPK（Map激酶）/ PI3K（PI3 激酶）通路，見圖 2。與其他兩個集群組合相比，“EMT”集群中的患者顯示出更短的無進(jìn)展生存期 (PFS), 見圖 3（p=0.03）。
圖 2：在基線腫瘤中，鑒定了具有不同蛋白質(zhì)表達(dá)譜的三個主要簇。表征每個簇的蛋白質(zhì)：簇 1富含EMT、ErbB 信號，簇 2富含DNA 損傷信號，簇 3富含p38 MAPK 和 PI3K 信號。
圖 3：由 RPPA 分析定義的宮頸癌患者亞組無進(jìn)展生存期（n=136）。 “EMT”簇（紅色）與 DNA 損傷和 MAPK/PI3K 信號（藍(lán)色）蛋白表達(dá)簇的結(jié)果比較表明，腫瘤顯示 EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的患者無進(jìn)展生存期較差。
此外，來自簇 1 樣本的特征不僅在于 EMT，還在于 PD-L1（程序性死亡配體 1 或 B7-H1）和 B7-H4（或 VTCN1，對于含有 V 組結(jié)構(gòu)域的 T 細(xì)胞激活抑制劑 1）的上調(diào)表達(dá)。見圖 4。
PD-L1 屬于 B7 蛋白家族。它是一種在抗原呈遞細(xì)胞（和一些癌細(xì)胞）表面表達(dá)的蛋白質(zhì)，與在T 細(xì)胞上的PD1 受體結(jié)合，當(dāng)它與其受體連接時，通過抑制 T 細(xì)胞活化來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。
B7-H4 也屬于 B7 蛋白家族，抑制 T 細(xì)胞活化、增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞毒性形成，負(fù)向調(diào)節(jié) T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。這就是為什么，在未來EMT 生物標(biāo)志物有可能鑒定出能受益于免疫檢查點(diǎn)抑制劑 (ICI) 療法的患者。最后，基于 RPPA 技術(shù)，在三個簇中觀察到 DNA 修復(fù)蛋白的表達(dá)和激活差異。這一結(jié)果可能會引起臨床對 PARP 抑制劑治療的興趣。
圖 4： RPPA 技術(shù)揭示的 PD-L1 和 B7-H4 的相對表達(dá)水平。 PD-L1 的高表達(dá)水平和 簇1 - EMT 的低表達(dá)水平。
肝細(xì)胞癌 (HCC) 項(xiàng)目
肝細(xì)胞癌 (HCC) 是異質(zhì)性和侵襲性腫瘤。由于這種腫瘤分子機(jī)制的復(fù)雜性，目前的治療方案在晚期階段不是很有效，在生存方面的益處有限。
該項(xiàng)旨在發(fā)現(xiàn)可能對肝細(xì)胞癌有效的新化合物或分子和發(fā)現(xiàn)治療反應(yīng)生物標(biāo)志物。該平臺研究人員使用 RPPA（Caruso S 等人， Gastroenterology 2019，PMID：31063779）研究了 400 個樣本（包括 360 個人類肝腫瘤和非腫瘤組織以及 40 個肝癌衍生細(xì)胞系 (LCCL)）的生物活性。并分析了涉及各種信號通路的 126 種蛋白質(zhì)； 82 種總蛋白和 44 種磷酸化蛋白，總共 215 張載玻片微陣列。在 LCCL 數(shù)據(jù)中，RPPA 結(jié)果的無監(jiān)督聚類將 LCCL 分為 3 個亞組，這些亞組反映了轉(zhuǎn)錄組亞群和細(xì)胞分化狀態(tài)（見圖 5）。 
圖 5：LCCL 蛋白質(zhì)圖譜的分層聚類以及與轉(zhuǎn)錄組亞群的關(guān)聯(lián)（c2 檢驗(yàn)）。第 1 簇：祖細(xì)胞亞類，第 2 組：混合上皮間充質(zhì)，第 3 組：間充質(zhì)樣細(xì)胞
在簇 1（祖細(xì)胞亞類）中，肝特異性基因和胎/祖細(xì)胞標(biāo)記物（ALDH1A1、E-鈣粘蛋白、p190A、RSK2、Her3、FGFR4、細(xì)胞角蛋白 19）表達(dá)良好，而它們在簇 3（間充質(zhì)樣細(xì)胞）中下調(diào).
簇 2（混合上皮、間充質(zhì)）和簇 3 有高表達(dá)水平的 TGF-β，沒有典型的 β-連環(huán)蛋白和 EMT 蛋白，這表明這些細(xì)胞的 WNT 和 TGF-β 通路被激活，見圖 6 。
圖 6：RPPA方法LCCL 蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平。 LCCL 轉(zhuǎn)錄組亞組之間差異表達(dá)的 19 種蛋白質(zhì)的箱線圖（Mann-Whitney 檢驗(yàn)）。
細(xì)胞系和腫瘤的 RPPA 數(shù)據(jù)結(jié)合基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)表明，肝癌細(xì)胞系的蛋白質(zhì)譜似乎代表了來自患者的最具侵襲性肝細(xì)胞癌，是了解肝癌發(fā)展和藥物反應(yīng)的好工具。摘要如圖 7 所示。
圖 7：肝細(xì)胞癌分子分型。先前建立的肝細(xì)胞癌分子分型及其相應(yīng)的肝癌衍生細(xì)胞系亞組與本研究中發(fā)現(xiàn)的主要藥物與生物標(biāo)志物的關(guān)聯(lián)總結(jié)。從以前研究總結(jié)的肝細(xì)胞癌分子分型和相關(guān)特征。 Ampl，放大； mut，突變。
結(jié)論:
反相蛋白質(zhì)微陣列是一種基于抗體的微型高通量技術(shù)，可以從少量生物樣品中檢測數(shù)百種蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白質(zhì)。 RPPA 的靈敏度與 InnoScan 710-IR掃描儀相結(jié)合是完美的組合，可以為您的研究項(xiàng)目提供將磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)方法與其他組學(xué)方法相結(jié)合的機(jī)會。這一強(qiáng)大的研究工具可幫助您研究信號通路，了解藥物的作用機(jī)制，并為預(yù)后或治療目標(biāo)尋找新的生物標(biāo)志物。
參考文獻(xiàn):
1) Loebke C. et al., (2007). Infrared-based protein detection arrays for quantitative proteomics. Proteomics.
2) Calvert VS. et al., (2004). Development of multiplexed protein profiling and detection using near infrared detection of reverse phase protein microarrays. Clinical Proteomics.
3) Dupuy L. et al., (2009). A highly sensitive near-infrared fluorescent detection method to analyze signalling pathways by reverse- phase protein array. Proteomics.
4) Brase JC. et al., (2011). Antibody-mediated signal amplification for reverse phase protein array-based protein quantification. Methods in Molecular Biology.
5) Troncale S. et al., (2012). NormaCurve: a SuperCurve-based method that
simultaneously quantifies and normalizes reverse phase protein array data. PLoS One.
6) Caruso S. et al., (2019). Analysis of Liver Cancer Cell Lines Identifies Agents With Likely Efficacy Against Hepatocellular Carcinoma and Markers of Response. Gastroenterology.
7) Scholl S. et al., (2019). Clinical and genetic landscape of treatment naive cervical cancer: Alterations in PIK3CA and in epigenetic modulators associated with sub-optimal outcome. EBioMedicine.
本文描述的反相蛋白質(zhì)微陣列 (RPPA) 平臺位于巴黎（法國）居里研究所內(nèi)。 該RPPA 平臺的總體目標(biāo)是通過信號通路分析提供關(guān)于蛋白表達(dá)水平及其活性的生物學(xué)新見解，最終目標(biāo)是改善癌癥患者的治療和療效。該平臺使用高通量自動化設(shè)備（包括 InnoScan 710-IR 掃描儀）對各種類型的微量樣品進(jìn)行個性化蛋白質(zhì)組學(xué)分析。 將介紹 RPPA 技術(shù)的基礎(chǔ)知識，并指出 InnoScan 710-IR 的日常使用如何成為該平臺工作流程的重要組成部分。最后將描述居里研究所進(jìn)行的癌癥研究應(yīng)用案例，以說明 InnoScan 710-IR 的易用性和可靠性。
正文
反相蛋白微陣列 (RPPA) 是一種高通量小型化斑點(diǎn)印跡和基于抗體的技術(shù)（圖 1A），可以分析蛋白表達(dá)水平和信號通路的激活狀態(tài)（通過研究磷酸化或總蛋白表達(dá)）。它結(jié)合了高通量分析和消耗微量樣品的優(yōu)點(diǎn)。事實(shí)上，由于 RPPA 技術(shù)是一種多指標(biāo)檢測技術(shù)，因此可以在同一張覆有硝酸纖維素的載玻片芯片（微陣列）上同時分析多達(dá)一千個樣本。RPPA 工作流程在圖 1，B 中進(jìn)行了描述。使用專用芯片點(diǎn)樣儀，每個樣品和每個點(diǎn)僅打印 1 至 2 ng 的細(xì)胞或組織裂解液。點(diǎn)樣的樣本可以是腫瘤樣本、異種移植物、細(xì)胞系或這些樣本的組合，并以連續(xù)稀釋和復(fù)制的方式系統(tǒng)性地點(diǎn)樣，使該技術(shù)具有高穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)可定量。然后，使用自動染色機(jī)，將微陣列按序與抗體和熒光染料孵育以檢測感興趣的蛋白（圖 1A）：
在居里研究所，RPPA 平臺測試了 2000 多種商業(yè)抗體，并驗(yàn)證了 640 種用于 RPPA 標(biāo)記的一抗，其中近 150 種抗磷酸化蛋白。這組抗體涵蓋了大多數(shù)細(xì)胞信號通路。對于每個項(xiàng)目，研究員從經(jīng)過驗(yàn)證的抗體中選擇感興趣的抗體。 RPPA 平臺不斷評估新抗體，并驗(yàn)證特定抗體以滿足合作者的要求。陽性和陰性對照使用標(biāo)有總蛋白染色 FCF（來自 Grace Biolabs 的方案）標(biāo)記的微陣列作為陽性對照，未標(biāo)記一抗的微陣列作為陰性對照。在量化和數(shù)據(jù)分析之前（圖 1C），用InnoScan 710-IR檢測每個樣品點(diǎn)的紅外熒光。掃描儀有兩個激發(fā)激光：785nm 和 670nm。得益于實(shí)時自動對焦和自動進(jìn)樣器，可以連續(xù)自動掃描 24 張芯片。10µm/像素掃描精度，在 4 分鐘時間內(nèi)完成一張載玻片芯片的掃描。載玻片上的硝酸纖維素在紅色光譜中具有自發(fā)熒光。研究人員選擇使用近紅外熒光來降低硝酸纖維素的背景熒光，提高信噪比。 InnoScan 710-IR 規(guī)格完全符合需提供可靠數(shù)據(jù)的要求，其靈敏度與比色檢測相似，但線性范圍更寬。
圖 1：反相蛋白質(zhì)微陣列工作流程說明。 A. RPPA 的原理，小型化高通量斑點(diǎn)印跡。在使用熒光標(biāo)記抗體檢測蛋白質(zhì)之前，將蛋白質(zhì)打印到硝酸纖維素膜載玻片上。 B. 從蛋白質(zhì)提取到通過 InnoScan 710-IR采集圖像的工作流程。 C. 使用 PARYS 軟件對圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
癌癥研究的應(yīng)用：
該RPPA 平臺參與了多種項(xiàng)目，涵蓋臨床試驗(yàn)評估相關(guān)基本問題，對合作者提供的樣本提供個性化的高通量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，允許：
- 蛋白表達(dá)水平分析
- 細(xì)胞信號通路激活狀態(tài)及動態(tài)分析
- 預(yù)后或預(yù)測性生物標(biāo)志物的鑒定
- 鑒定潛在治療靶點(diǎn)
- 基于蛋白質(zhì)譜的樣品分類
- 藥效學(xué)研究
宮頸癌 (CC)：RAIDs 聯(lián)盟歐洲項(xiàng)目
宮頸癌 (CC) 仍然是女性中第二大最常見的癌癥。大多數(shù)宮頸癌是由高危型人乳頭瘤病毒 (HPV) 的持續(xù)感染引起的。事實(shí)上，它們通過病毒蛋白 E6 和 E7 使正常細(xì)胞控制失效，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定、分子改變的積累、抑癌基因失活和癌基因激活。 RAIDs 歐盟 (EU) 資助的研究在 2013 年至 2017 年間收集了前瞻性宮頸癌樣本（腫瘤和血液）和臨床數(shù)據(jù)集，涉及來自七個歐盟國家 18 個中心的 419 名參與患者。到目前為止，已經(jīng)進(jìn)行了下一代測序（NGS），能夠解析顯性遺傳改變，并且應(yīng)用反相蛋白質(zhì)微陣列（RPPA）研究細(xì)胞信號通路。
居里研究所RPPA 平臺處理了 280 個樣本，包括基線和非基線腫瘤和細(xì)胞系。如前所述（Scholl S, et al., EBioMedicine 2019, PMID: 30952619）進(jìn)行樣品處理（蛋白質(zhì)提取、定量、連續(xù)稀釋、陣列點(diǎn)印、標(biāo)記、掃描、定量和分析）。
采用 194 種特異性一抗對蛋白質(zhì)反向微陣列進(jìn)行檢測。使用 InnoScan 710-IR (INNOPSYS) 掃描了355張載玻片微陣列 ，785 nm波段用于檢測抗體或陰性對照，670nm波段用于檢測陽性對照。
RPPA 蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)的無監(jiān)督聚類揭示了三個患者群，分別為富含 EMT（上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化）、DNA 損傷信號和 MAPK（Map激酶）/ PI3K（PI3 激酶）通路，見圖 2。與其他兩個集群組合相比，“EMT”集群中的患者顯示出更短的無進(jìn)展生存期 (PFS), 見圖 3（p=0.03）。
圖 2：在基線腫瘤中，鑒定了具有不同蛋白質(zhì)表達(dá)譜的三個主要簇。表征每個簇的蛋白質(zhì)：簇 1富含EMT、ErbB 信號，簇 2富含DNA 損傷信號，簇 3富含p38 MAPK 和 PI3K 信號。
圖 3：由 RPPA 分析定義的宮頸癌患者亞組無進(jìn)展生存期（n=136）。 “EMT”簇（紅色）與 DNA 損傷和 MAPK/PI3K 信號（藍(lán)色）蛋白表達(dá)簇的結(jié)果比較表明，腫瘤顯示 EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的患者無進(jìn)展生存期較差。
此外，來自簇 1 樣本的特征不僅在于 EMT，還在于 PD-L1（程序性死亡配體 1 或 B7-H1）和 B7-H4（或 VTCN1，對于含有 V 組結(jié)構(gòu)域的 T 細(xì)胞激活抑制劑 1）的上調(diào)表達(dá)。見圖 4。
PD-L1 屬于 B7 蛋白家族。它是一種在抗原呈遞細(xì)胞（和一些癌細(xì)胞）表面表達(dá)的蛋白質(zhì)，與在T 細(xì)胞上的PD1 受體結(jié)合，當(dāng)它與其受體連接時，通過抑制 T 細(xì)胞活化來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。
B7-H4 也屬于 B7 蛋白家族，抑制 T 細(xì)胞活化、增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞毒性形成，負(fù)向調(diào)節(jié) T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。這就是為什么，在未來EMT 生物標(biāo)志物有可能鑒定出能受益于免疫檢查點(diǎn)抑制劑 (ICI) 療法的患者。最后，基于 RPPA 技術(shù)，在三個簇中觀察到 DNA 修復(fù)蛋白的表達(dá)和激活差異。這一結(jié)果可能會引起臨床對 PARP 抑制劑治療的興趣。
肝細(xì)胞癌 (HCC) 項(xiàng)目
肝細(xì)胞癌 (HCC) 是異質(zhì)性和侵襲性腫瘤。由于這種腫瘤分子機(jī)制的復(fù)雜性，目前的治療方案在晚期階段不是很有效，在生存方面的益處有限。
該項(xiàng)旨在發(fā)現(xiàn)可能對肝細(xì)胞癌有效的新化合物或分子和發(fā)現(xiàn)治療反應(yīng)生物標(biāo)志物。該平臺研究人員使用 RPPA（Caruso S 等人， Gastroenterology 2019，PMID：31063779）研究了 400 個樣本（包括 360 個人類肝腫瘤和非腫瘤組織以及 40 個肝癌衍生細(xì)胞系 (LCCL)）的生物活性。并分析了涉及各種信號通路的 126 種蛋白質(zhì)； 82 種總蛋白和 44 種磷酸化蛋白，總共 215 張載玻片微陣列。在 LCCL 數(shù)據(jù)中，RPPA 結(jié)果的無監(jiān)督聚類將 LCCL 分為 3 個亞組，這些亞組反映了轉(zhuǎn)錄組亞群和細(xì)胞分化狀態(tài)（見圖 5）。
圖 5：LCCL 蛋白質(zhì)圖譜的分層聚類以及與轉(zhuǎn)錄組亞群的關(guān)聯(lián)（c2 檢驗(yàn)）。第 1 簇：祖細(xì)胞亞類，第 2 組：混合上皮間充質(zhì)，第 3 組：間充質(zhì)樣細(xì)胞
在簇 1（祖細(xì)胞亞類）中，肝特異性基因和胎/祖細(xì)胞標(biāo)記物（ALDH1A1、E-鈣粘蛋白、p190A、RSK2、Her3、FGFR4、細(xì)胞角蛋白 19）表達(dá)良好，而它們在簇 3（間充質(zhì)樣細(xì)胞）中下調(diào).
簇 2（混合上皮、間充質(zhì)）和簇 3 有高表達(dá)水平的 TGF-β，沒有典型的 β-連環(huán)蛋白和 EMT 蛋白，這表明這些細(xì)胞的 WNT 和 TGF-β 通路被激活，見圖 6 。
圖 6：RPPA方法LCCL 蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平。 LCCL 轉(zhuǎn)錄組亞組之間差異表達(dá)的 19 種蛋白質(zhì)的箱線圖（Mann-Whitney 檢驗(yàn)）。
細(xì)胞系和腫瘤的 RPPA 數(shù)據(jù)結(jié)合基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)表明，肝癌細(xì)胞系的蛋白質(zhì)譜似乎代表了來自患者的最具侵襲性肝細(xì)胞癌，是了解肝癌發(fā)展和藥物反應(yīng)的好工具。摘要如圖 7 所示。
圖 7：肝細(xì)胞癌分子分型。先前建立的肝細(xì)胞癌分子分型及其相應(yīng)的肝癌衍生細(xì)胞系亞組與本研究中發(fā)現(xiàn)的主要藥物與生物標(biāo)志物的關(guān)聯(lián)總結(jié)。從以前研究總結(jié)的肝細(xì)胞癌分子分型和相關(guān)特征。 Ampl，放大； mut，突變。
結(jié)論:
反相蛋白質(zhì)微陣列是一種基于抗體的微型高通量技術(shù)，可以從少量生物樣品中檢測數(shù)百種蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白質(zhì)。 RPPA 的靈敏度與 InnoScan 710-IR掃描儀相結(jié)合是完美的組合，可以為您的研究項(xiàng)目提供將磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)方法與其他組學(xué)方法相結(jié)合的機(jī)會。這一強(qiáng)大的研究工具可幫助您研究信號通路，了解藥物的作用機(jī)制，并為預(yù)后或治療目標(biāo)尋找新的生物標(biāo)志物。
參考文獻(xiàn):
1) Loebke C. et al., (2007). Infrared-based protein detection arrays for quantitative proteomics. Proteomics.
2) Calvert VS. et al., (2004). Development of multiplexed protein profiling and detection using near infrared detection of reverse phase protein microarrays. Clinical Proteomics.
3) Dupuy L. et al., (2009). A highly sensitive near-infrared fluorescent detection method to analyze signalling pathways by reverse- phase protein array. Proteomics.
4) Brase JC. et al., (2011). Antibody-mediated signal amplification for reverse phase protein array-based protein quantification. Methods in Molecular Biology.
5) Troncale S. et al., (2012). NormaCurve: a SuperCurve-based method that
simultaneously quantifies and normalizes reverse phase protein array data. PLoS One.
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