清華大學生物育種技術與裝備團隊開發(fā)微升級單細胞液滴篩選系統(tǒng)用于微生物高通量自動化單克隆培養(yǎng)與分選。

單克隆菌落的分離、培養(yǎng)和挑取是微生物研究的關鍵操作。1881年，Robert Koch發(fā)明了在固體平板上進行微生物純培養(yǎng)的方法，已經(jīng)成為微生物單克隆培養(yǎng)和挑取的標準方法之一。然而在面對日益多樣的高通量需求時，基于固體平板的方法由于通量低、培養(yǎng)基利用率低以及存在大量的人工操作，通常要消耗大量人力物力。雖然近些年也發(fā)展了一些整合菌落挑取儀、移液工作站等儀器與機械臂的自動化工作站，但這種平臺復雜而昂貴。近年來液滴微流控技術的發(fā)展為自動化高通量微生物培養(yǎng)和篩選提供了新的解決方案。然而目前大多數(shù)相關系統(tǒng)使用皮納升液滴，由于其體積小，導致檢測方面諸如檢測靈敏度低，高度依賴特定的化學試劑和探針，檢測設備復雜昂貴等問題。同時這些系統(tǒng)通常以堆疊的方式培養(yǎng)液滴，較難單獨和依次收集目標液滴，不能完全實現(xiàn)單克隆菌落的單獨獲取。

近日，清華大學化工系生物育種技術與裝備團隊在生物工程領域國際知名期刊Biotechnology and Bioengineering上發(fā)表了題為“Single‐cell microliter‐droplet screening system (MISS Cell): An integrated platform for automated high‐throughput microbial monoclonal cultivation and picking”的文章，論文通訊作者為張翀副教授。文章報道了一種自動化和集成化的微流控平臺——微升級單細胞液滴篩選系統(tǒng)（MISS Cell），可用于在2.0-2.5 μL的液滴中進行自動化高通量的微生物單克隆培養(yǎng)和分選，通量可達104。MISS Cell是一個高度集成的系統(tǒng)，主要由四個模塊組成，包括進樣模塊、微流控芯片模塊、液滴存儲和培養(yǎng)模塊以及液滴檢測和收集模塊。MISS Cell生成微升級單細胞液滴，在透氣性培養(yǎng)盤中儲存與培養(yǎng)液滴。培養(yǎng)完成后，通過光譜檢測和特定算法進行液滴識別與基于OD檢測的自動分選。MISS Cell采用特殊的機械結(jié)構，通過液滴打印的方式與標準化容器，如96微孔板、8聯(lián)排PCR管等對接，實現(xiàn)液滴的自動化收集（圖1）。  圖1  MISS Cell的結(jié)構和原理示意圖。（a）MISS Cell的整體結(jié)構；（b）液滴識別和OD檢測的原理；（c）液滴分選和收集。

文章通過分離和培養(yǎng)用兩種不同顏色熒光標記的同種細菌的混合溶液，驗證了微升級單細胞液的產(chǎn)生。通過使用三種不同的混合菌液（mCherry和sfGFP標記的大腸桿菌，RFP和EGFP標記的谷氨酸棒桿菌以及mCherry和YPet標記的釀酒酵母）進行廣泛的統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)將泊松分布λ控制在0.035-0.145之間時，可確保產(chǎn)生較多的單細胞液滴，其占總液滴的3.4%-12.6%。MISS Cell的適用范圍包括常見的細菌、酵母、使用孢子繁殖的絲狀真菌和放線菌等（圖2）。  圖2  MISS Cell中單克隆培養(yǎng)和分選的操作流程和驗證結(jié)果。（a）固體平板方法和MISS Cell培養(yǎng)方法的操作流程比較；（b）單細胞液滴生成的原理和雙色熒光菌體系驗證原理；（c）使用紅色和綠色熒光標記的大腸桿菌的驗證結(jié)果，λ=0.086；（d）使用大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌和釀酒酵母進行驗證的結(jié)果匯總。

文章首次系統(tǒng)地探究了微升級單細胞液滴的各項性能。MISS Cell中微升級液滴具有良好的體積一致性，生成液滴的體積變異系數(shù)為1.88%。MISS Cell對液滴及其揮發(fā)性底物具有優(yōu)秀的保留能力，支持微生物的長期培養(yǎng)。和微孔板、深孔板相比，微升級液滴具有良好的培養(yǎng)性能和微生物生長一致性，有利于微生物的檢測和篩選。和固體平板相比，微升級液滴培養(yǎng)前期生物量增長快于固體平板，有利于更早進行單菌落的挑取，縮短培養(yǎng)時間，提高工作效率（圖3）。  圖3  MISS Cell中微升級液滴性能表征。（a）生成液滴的體積變化；（b）液滴揮發(fā)情況；（c）液滴中底物（以甲醇為例）的揮發(fā)情況；（d）不同方法微生物培養(yǎng)的平行性；（e）微升級液滴和固體平板中單菌落生長速率比較。Scale bar = 400 μm。

分子克隆的培養(yǎng)和挑取是合成生物學的基本實驗操作，通常使用固體平板進行。文章使用MISS Cell來培養(yǎng)和挑選分子克隆，并通過測序，根據(jù)測序峰圖是否由單一或雜合峰組成，評估每個菌落的單克隆性。結(jié)果顯示，來自MISS Cell的單菌落的測序雜合峰比例為5.52%和4.35%，與固體平板的結(jié)果（2.50%和4.12%）相似，且都低于某生物公司的長期實驗數(shù)據(jù)（7.68%）。這進一步表明，MISS Cell中的微升級液滴培養(yǎng)物具有良好的單克隆性，可用于分子克隆的培養(yǎng)和挑�。▓D4）。 圖4  MISS Cell中分子克隆的培養(yǎng)和分選。（a）使用MISS Cell和固體平板方法進行分子克隆的操作流程；（b）來自固體平板和MISS Cell的不同菌落的測序峰圖；（c）使用不同的DNA連接產(chǎn)物的測試結(jié)果。

文章建立了基于MISS Cell的微生物誘變篩選工作流程，并對Corynebacterium glutamicum B2H001進行高谷氨酸（Glu）產(chǎn)量表型菌株的篩選。首先，使用常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）處理C. glutamicum B2H001獲得突變體庫。接下來使用MISS Cell對突變體進行培養(yǎng)，并進行單克隆菌落的分選。文章使用了一個基于強度的谷氨酸感應熒光報告器（intensity-based glutamate-sensing fluorescent reporter，iGluSnFr）進行Glu的特異性檢測。文章在3500個液滴中分選收到502個單克隆，檢測后選取了11株信號相對較強的菌株進行后續(xù)驗證。最終驗證得到的1J11和1P18突變體，搖瓶培養(yǎng)的谷氨酸產(chǎn)量分別提升了25.8%和19.1%。MISS Cell實現(xiàn)了關鍵流程的自動化，即單克隆菌落的培養(yǎng)和挑取，具有很高的通量，并省去了單克隆再培養(yǎng)的步驟，節(jié)省了人力物力和時間（圖5）。  圖5  C. glutamicum B2H001在MISS Cell中的篩選流程和結(jié)果。（a）MISS Cell和傳統(tǒng)固體平板之間的菌種誘變篩選流程比較；（b）iGlusnFr檢測Glu的工作示意圖；（c）iGlusnFr對Glu的反應曲線；（d）使用iGlusnFr作為傳感器在MISS Cell中培養(yǎng)的初始菌株的Glu產(chǎn)量時間曲線；（e）MISS Cell篩選和24深孔板的驗證結(jié)果；（f）菌株1J11、1A2、1P18和1K1在搖瓶中的進一步驗證結(jié)果。

綜上，該研究工作開發(fā)的微升級單細胞液滴篩選系統(tǒng)（MISS Cell）自動集成化平臺，可用于自動化高通量微生物單克隆培養(yǎng)和挑選。與固體平板法相比，MISS Cell具有更高的產(chǎn)量、更低的試劑消耗和更多的自動化操作，可以節(jié)省大量的人力和物力。與皮升級液滴相比，MISS Cell使用更簡單的光學信號檢測，同時可以精準識別液滴，使液滴可尋址（圖6）。MISS Cell有望成為一個通用的操作平臺，在高通量的應用場景中大大提高單克隆菌落的獲取效率，解除固體平板在通量和操作上的限制，以促進生物技術發(fā)展。  圖6 固體平板、皮升級液滴和MISS Cell培養(yǎng)的比較

論文鏈接:https://doi.org/10.1002/bit.28300
背景信息

高通量微升級液滴培養(yǎng)組學系統(tǒng)（single cell microliter-droplet culture omics system, MISS cell culture omics），是天木生物基于微升級液滴技術開發(fā)的微型化、高通量、自動化細胞培養(yǎng)及分選裝備。本儀器單次運行可完成約5000~10000個液滴的生成，并將液滴存儲于高透氣性管路中進行培養(yǎng)，最后對液滴進行光學檢測，并將目標液滴分選至多孔板中。本儀器還具有培養(yǎng)體系均一性好、操作自動化程度高等特點，還可以實現(xiàn)絲狀菌的培養(yǎng)；本儀器還可以對液滴進行多種單元操作，豐富了檢測手段；儀器結(jié)構緊湊，可以整體放入?yún)捬醪僮飨�，實現(xiàn)厭氧微生物的培養(yǎng)與篩選。本儀器用途廣泛，可以實現(xiàn)單克隆的自動化生成與培養(yǎng)、及篩選，對各類環(huán)境樣本在單細胞水平上進行分離、培養(yǎng)、分選等（如環(huán)境微生物、腸道菌群等）。