文獻(xiàn)解讀：新冠病毒核酸rRT-PCR分析注意事項(xiàng)
題目：rRT-PCR for SARS-CoV-2: Analytical considerations
期刊：Clinica Chimica Acta 516（2021）1-7
通訊作者：Mohammad Abdi
DOI號：10.1016/j.cca.2021.01.011
編譯：俞萍
一、背景介紹
新冠疫情仍然是全世界衛(wèi)生系統(tǒng)面臨的一個重大問題。早期準(zhǔn)確檢測新冠病毒感染對于最大限度地減少傳播和治療至關(guān)重要。在檢測方法中，實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rRT-PCR)被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)。
該檢測方法具有較高的特異性和靈敏性，但對于有癥狀的或CT掃描呈陽性的患者中出現(xiàn)假陰性結(jié)果來說仍然是一個挑戰(zhàn)。誤差來源可能是分析前(采樣、儲存和處理)、分析中(RNA提取、cDNA合成和擴(kuò)增)和分析后(解釋和分析)。文章總結(jié)了這些潛在的誤差來源和減少誤差的措施。
二、分析前誤差
分析前最重要的誤差來源之一發(fā)生在取樣步驟中。其中最關(guān)鍵的是正確的采樣位置，包括鼻子、喉嚨和氣管導(dǎo)管等，要使用標(biāo)準(zhǔn)采樣耗材（尼龍植絨而非棉簽）進(jìn)行采樣，拭子應(yīng)在適當(dāng)位置保持10秒并旋轉(zhuǎn)三次。采樣過程中，如果拭子被手套粉末、喉嚨末端的食物碎屑等污染物浸透，會對結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生不利影響。
取樣后將這些誤差降至最低的方法是將拭子快速轉(zhuǎn)移到合適的運(yùn)輸介質(zhì)中，并快速送到實(shí)驗(yàn)室，同時控制運(yùn)輸溫度（2–8℃）和時間（72小時內(nèi)）。
不正確的取樣和儲存可能是產(chǎn)生錯誤結(jié)果的重要來源，特別是在病毒載量低的樣本中。多項(xiàng)研究表明，在疾病的早期階段，病毒大多位于鼻部，因此在此期間從喉嚨中采樣更可能是假陰性，建議在癥狀出現(xiàn)后5或6天采集鼻咽和口咽拭子。
三、分析中誤差
分析中重要誤差可能發(fā)生在核酸提取步驟中，對所提取RNA的數(shù)量和質(zhì)量有很大影響。核酸提取過程中的主要污染蛋白是核酸結(jié)合蛋白，它可以干擾cDNA合成反應(yīng)，特別是PCR過程。選擇合適的RNA提取方法是獲得有效結(jié)果的關(guān)鍵步驟，自動化磁珠法核酸提取被認(rèn)為是最安全和最快的方法，這種方法只需要很少的人工干預(yù)。
內(nèi)源性和外源性核糖核酸酶降解RNA也可能影響提取RNA的質(zhì)量和數(shù)量，并導(dǎo)致假陰性結(jié)果。最終洗脫的核糖核酸應(yīng)溶于不含RNA酶的水中，以防止RNA降解導(dǎo)致假陰性結(jié)果。核酸提取過程中有幾種試劑會降低PCR效率，如手套粉末、鹽、去污劑以及苯酚和乙醇等有機(jī)分子，因此在RNA提取過程中應(yīng)避免使用或盡量減少使用。此外，避免提取的核酸暴露于紫外線照射也很重要。同時為了避免分子實(shí)驗(yàn)室環(huán)境受到氣溶膠的影響，需要分區(qū)域?qū)嶒?yàn)。
cDNA合成和擴(kuò)增中引物和探針的儲存也是重要因素，反復(fù)凍融和長時間的光暴露降低了穩(wěn)定性和反應(yīng)效率。準(zhǔn)確移取RNA和酶在cDNA合成過程中起主要作用，移液方法和移液器應(yīng)該都是校驗(yàn)過的。在一步法的RNA逆轉(zhuǎn)錄和cDNA擴(kuò)增中，對于RNA水平較低的樣本，擴(kuò)增效率低導(dǎo)致錯誤分析時有發(fā)生。高濃度的逆轉(zhuǎn)錄酶對擴(kuò)增有抑制作用。
PCR儀校準(zhǔn)發(fā)生故障也有可能導(dǎo)致不準(zhǔn)確的擴(kuò)增溫度和循環(huán)時間。新冠病毒rRT-PCR檢測中最重要的挑戰(zhàn)之一是選擇效率最高的引物，已證實(shí)ORF1ab、N和RdRp引物比其他引物具有更高的敏感性、特異性和陽性預(yù)測價值。病毒基因組發(fā)生突變和重組，使得新冠肺炎檢測相當(dāng)困難。為了提高方法的靈敏度并克服這一問題，應(yīng)更多地考慮引物濃度、引物退火和設(shè)計(jì)用于多靶點(diǎn)檢測的引物，在篩選擴(kuò)增程序中應(yīng)考慮使用不同引物的組合策略來提高檢測能力。
通過常用rRT-PCR方法產(chǎn)生假陰性結(jié)果的最重要原因之一是病毒載量低導(dǎo)致，研究表明數(shù)字PCR在檢測低病毒載量樣本方面比rRT- qPCR具有更高的靈敏度和特異性。
四、分析后誤差
新冠肺炎檢測相關(guān)的分析后誤差并不是很多。最常見的誤差來源之一是操作員對數(shù)據(jù)的錯誤解讀。通過基線、閾值和擴(kuò)增曲線繪制精確的圖表，并確保檢測靈敏度，可以大大降低這些錯誤解讀的可能性。頻繁凍融標(biāo)準(zhǔn)溶液也會增加CT值，所以標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)避免反復(fù)凍融影響結(jié)果判讀。
擴(kuò)增曲線對于確定基線和閾值循環(huán)很重要，新冠肺炎陽性的rRT-PCR結(jié)果的CT值應(yīng)小于40，大于40的結(jié)果應(yīng)視為陰性結(jié)果。CT值為37–40的樣本必須重新取樣檢測。
對內(nèi)標(biāo)無擴(kuò)增首先分析PCR過程是否有問題。如果PCR重復(fù)結(jié)果還是如此，則需要重新取樣檢測。實(shí)時PCR是一種非常靈敏的方法，因此移液、組分質(zhì)量、設(shè)備校準(zhǔn)和溫度等都可能會導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定和不準(zhǔn)確。因此，使用內(nèi)標(biāo)可以提高PCR過程的準(zhǔn)確性。
實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的效率是一個關(guān)鍵因素。最佳效率為90 ~ 110%，最佳擴(kuò)增效率是獲得準(zhǔn)確PCR結(jié)果的必要條件，在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析之前應(yīng)予以考慮。
期刊：Clinica Chimica Acta 516（2021）1-7
通訊作者：Mohammad Abdi
DOI號：10.1016/j.cca.2021.01.011
編譯：俞萍
一、背景介紹
新冠疫情仍然是全世界衛(wèi)生系統(tǒng)面臨的一個重大問題。早期準(zhǔn)確檢測新冠病毒感染對于最大限度地減少傳播和治療至關(guān)重要。在檢測方法中，實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rRT-PCR)被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)。
該檢測方法具有較高的特異性和靈敏性，但對于有癥狀的或CT掃描呈陽性的患者中出現(xiàn)假陰性結(jié)果來說仍然是一個挑戰(zhàn)。誤差來源可能是分析前(采樣、儲存和處理)、分析中(RNA提取、cDNA合成和擴(kuò)增)和分析后(解釋和分析)。文章總結(jié)了這些潛在的誤差來源和減少誤差的措施。
二、分析前誤差
分析前最重要的誤差來源之一發(fā)生在取樣步驟中。其中最關(guān)鍵的是正確的采樣位置，包括鼻子、喉嚨和氣管導(dǎo)管等，要使用標(biāo)準(zhǔn)采樣耗材（尼龍植絨而非棉簽）進(jìn)行采樣，拭子應(yīng)在適當(dāng)位置保持10秒并旋轉(zhuǎn)三次。采樣過程中，如果拭子被手套粉末、喉嚨末端的食物碎屑等污染物浸透，會對結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生不利影響。
取樣后將這些誤差降至最低的方法是將拭子快速轉(zhuǎn)移到合適的運(yùn)輸介質(zhì)中，并快速送到實(shí)驗(yàn)室，同時控制運(yùn)輸溫度（2–8℃）和時間（72小時內(nèi)）。
三、分析中誤差
分析中重要誤差可能發(fā)生在核酸提取步驟中，對所提取RNA的數(shù)量和質(zhì)量有很大影響。核酸提取過程中的主要污染蛋白是核酸結(jié)合蛋白，它可以干擾cDNA合成反應(yīng)，特別是PCR過程。選擇合適的RNA提取方法是獲得有效結(jié)果的關(guān)鍵步驟，自動化磁珠法核酸提取被認(rèn)為是最安全和最快的方法，這種方法只需要很少的人工干預(yù)。
內(nèi)源性和外源性核糖核酸酶降解RNA也可能影響提取RNA的質(zhì)量和數(shù)量，并導(dǎo)致假陰性結(jié)果。最終洗脫的核糖核酸應(yīng)溶于不含RNA酶的水中，以防止RNA降解導(dǎo)致假陰性結(jié)果。核酸提取過程中有幾種試劑會降低PCR效率，如手套粉末、鹽、去污劑以及苯酚和乙醇等有機(jī)分子，因此在RNA提取過程中應(yīng)避免使用或盡量減少使用。此外，避免提取的核酸暴露于紫外線照射也很重要。同時為了避免分子實(shí)驗(yàn)室環(huán)境受到氣溶膠的影響，需要分區(qū)域?qū)嶒?yàn)。
cDNA合成和擴(kuò)增中引物和探針的儲存也是重要因素，反復(fù)凍融和長時間的光暴露降低了穩(wěn)定性和反應(yīng)效率。準(zhǔn)確移取RNA和酶在cDNA合成過程中起主要作用，移液方法和移液器應(yīng)該都是校驗(yàn)過的。在一步法的RNA逆轉(zhuǎn)錄和cDNA擴(kuò)增中，對于RNA水平較低的樣本，擴(kuò)增效率低導(dǎo)致錯誤分析時有發(fā)生。高濃度的逆轉(zhuǎn)錄酶對擴(kuò)增有抑制作用。
PCR儀校準(zhǔn)發(fā)生故障也有可能導(dǎo)致不準(zhǔn)確的擴(kuò)增溫度和循環(huán)時間。新冠病毒rRT-PCR檢測中最重要的挑戰(zhàn)之一是選擇效率最高的引物，已證實(shí)ORF1ab、N和RdRp引物比其他引物具有更高的敏感性、特異性和陽性預(yù)測價值。病毒基因組發(fā)生突變和重組，使得新冠肺炎檢測相當(dāng)困難。為了提高方法的靈敏度并克服這一問題，應(yīng)更多地考慮引物濃度、引物退火和設(shè)計(jì)用于多靶點(diǎn)檢測的引物，在篩選擴(kuò)增程序中應(yīng)考慮使用不同引物的組合策略來提高檢測能力。
通過常用rRT-PCR方法產(chǎn)生假陰性結(jié)果的最重要原因之一是病毒載量低導(dǎo)致，研究表明數(shù)字PCR在檢測低病毒載量樣本方面比rRT- qPCR具有更高的靈敏度和特異性。
四、分析后誤差
新冠肺炎檢測相關(guān)的分析后誤差并不是很多。最常見的誤差來源之一是操作員對數(shù)據(jù)的錯誤解讀。通過基線、閾值和擴(kuò)增曲線繪制精確的圖表，并確保檢測靈敏度，可以大大降低這些錯誤解讀的可能性。頻繁凍融標(biāo)準(zhǔn)溶液也會增加CT值，所以標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)避免反復(fù)凍融影響結(jié)果判讀。
擴(kuò)增曲線對于確定基線和閾值循環(huán)很重要，新冠肺炎陽性的rRT-PCR結(jié)果的CT值應(yīng)小于40，大于40的結(jié)果應(yīng)視為陰性結(jié)果。CT值為37–40的樣本必須重新取樣檢測。
對內(nèi)標(biāo)無擴(kuò)增首先分析PCR過程是否有問題。如果PCR重復(fù)結(jié)果還是如此，則需要重新取樣檢測。實(shí)時PCR是一種非常靈敏的方法，因此移液、組分質(zhì)量、設(shè)備校準(zhǔn)和溫度等都可能會導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定和不準(zhǔn)確。因此，使用內(nèi)標(biāo)可以提高PCR過程的準(zhǔn)確性。
實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的效率是一個關(guān)鍵因素。最佳效率為90 ~ 110%，最佳擴(kuò)增效率是獲得準(zhǔn)確PCR結(jié)果的必要條件，在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析之前應(yīng)予以考慮。
五、結(jié)論
文章總結(jié)分析了假陰性或假陽性結(jié)果的一些可能來源。分析前誤差被認(rèn)為是新冠肺炎診斷中的主要可能誤差來源，包括采樣耗材、采樣位置和采樣時間。在分析階段，RNA提取是主要關(guān)注點(diǎn)，其數(shù)量和質(zhì)量是重要因素。同時通過引物設(shè)計(jì)、儲存條件、PCR組分和移液器校準(zhǔn)來優(yōu)化rRT-PCR過程，如果病毒基因組發(fā)生突變，則應(yīng)優(yōu)化新的引物。
在分析后階段，必須使用各種陽性和陰性對照品來確認(rèn)和解釋結(jié)果。因此，使用質(zhì)控品對每次檢測都至關(guān)重要，同時分析解釋數(shù)據(jù)的人員應(yīng)該具有專業(yè)知識和能力。
文章總結(jié)分析了假陰性或假陽性結(jié)果的一些可能來源。分析前誤差被認(rèn)為是新冠肺炎診斷中的主要可能誤差來源，包括采樣耗材、采樣位置和采樣時間。在分析階段，RNA提取是主要關(guān)注點(diǎn)，其數(shù)量和質(zhì)量是重要因素。同時通過引物設(shè)計(jì)、儲存條件、PCR組分和移液器校準(zhǔn)來優(yōu)化rRT-PCR過程，如果病毒基因組發(fā)生突變，則應(yīng)優(yōu)化新的引物。
在分析后階段，必須使用各種陽性和陰性對照品來確認(rèn)和解釋結(jié)果。因此，使用質(zhì)控品對每次檢測都至關(guān)重要，同時分析解釋數(shù)據(jù)的人員應(yīng)該具有專業(yè)知識和能力。
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