介紹：

Azure Cielo™ 3和Cielo™ 6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)具有卓越的靈敏度。該系統(tǒng)配置新型的高性能光學(xué)系統(tǒng)，采用16組光纖單孔掃描設(shè)計(jì)，一根光纖用于高能LED激發(fā)，另一根用于光信號(hào)檢測，可16孔同時(shí)采集(圖1)。特殊的激發(fā)/發(fā)射方式保證單孔掃描時(shí)僅激發(fā)一個(gè)孔，光纖傳導(dǎo)也有效消除光散射，完全避免孔外區(qū)域的激發(fā)，減少背景噪聲的來源，以便更靈敏的檢測。

同時(shí)Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)采用“全孔檢測”技術(shù)，每個(gè)孔可采集大約100,000個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。檢測時(shí)取讀數(shù)的平均值，精準(zhǔn)測定每個(gè)孔的熒光強(qiáng)度。這種“全孔檢測”為每個(gè)采集時(shí)間點(diǎn)提供了比單孔掃描系統(tǒng)更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，因?yàn)閱慰讙呙柘到y(tǒng)僅僅采集少量的數(shù)據(jù)點(diǎn)。

如何可靠地檢測低拷貝數(shù)的靶標(biāo)呢？首先要考慮引物和探針的特異性，這會(huì)直接影響qPCR檢測能力的高低，其次考慮靈敏度，即當(dāng)探針信號(hào)高于背景噪聲時(shí)儀器檢測的靈敏度。在其他的反應(yīng)成分相同的情況下，更高靈敏度的儀器可以更早的檢測到信號(hào)或得到更小的Cq值。為了證明Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)在低拷貝數(shù)的靶標(biāo)檢測中的靈敏度和重復(fù)性，進(jìn)行了單拷貝靶標(biāo)DNA的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

方法：

配制20µl反應(yīng)體系，利用單拷貝DNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。

分別在Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)和競爭產(chǎn)品的系統(tǒng)上運(yùn)行兩次96孔板。使用每個(gè)儀器提供的軟件收集和分析數(shù)據(jù)，以確定每個(gè)孔的Cq值。

結(jié)果與討論：

單拷貝DNA擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)中檢測到88個(gè)孔(92%)有熒光信號(hào)，競爭產(chǎn)品中檢測到77個(gè)孔(80%)(圖2A)，結(jié)果表明，Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)提高了單拷貝擴(kuò)增的檢測概率，這也反映了其檢測靈敏度更高。那么對于單拷貝DNA擴(kuò)增來說，那些沒有熒光信號(hào)的孔可能是靶標(biāo)DNA沒有進(jìn)入到孔中，所以沒有檢測到熒光信號(hào)。

同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)測量的Cq平均值比競爭產(chǎn)品要早2個(gè)循環(huán)(Cq 36.39 vs 38.53)(圖2A)。并且Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)的Cq值SD小于競爭產(chǎn)品的值(0.91 vs 1.16)，這進(jìn)一步說明了Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)的檢測具有良好的重復(fù)性。

此外，將兩者的擴(kuò)增曲線進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在競爭產(chǎn)品上某些擴(kuò)增曲線起峰較晚，擴(kuò)增曲線起峰位置不一致（圖3B），Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)的擴(kuò)增曲線起峰位置基本一致（圖3A）。這也說明了Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)高靈敏度的“全孔檢測”技術(shù)和多數(shù)據(jù)點(diǎn)的捕獲方式可以給您帶來真實(shí)可靠的擴(kuò)增結(jié)果。

總的來說，隨著靶標(biāo)DNA數(shù)量的減少，qPCR的可靠性也會(huì)逐漸降低，然而現(xiàn)代應(yīng)用不斷突破這一技術(shù)的極限，對qPCR的性能提出了更高的要求。以上結(jié)果證明了Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)具有卓越的靈敏度和可靠性，即使檢測單拷貝DNA分子，仍可獲得具有高度重復(fù)性的定量數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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4. Tosiano MA, Jacobs JL, Shutt KA, et al. A Simpler and More Sensitive Single-Copy HIV-1 RNA Assay for Quantification of Persistent HIV-1 Viremia in Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy. J Clin Microbiol. 2019;57(3):e01714-e01718.