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非洲豬瘟病毒核酸檢測方案

瀏覽次數(shù):8479 發(fā)布日期:2019-3-1  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
1.常見樣本類型:
分泌物、血液、脾臟、扁桃體、腎臟和淋巴結等樣本中的非洲豬瘟。
2.. 樣品預處理方式(樣本處理區(qū))
2.1 樣本前處理
2.1.1組織樣品:每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g,手術剪剪碎混勻后取
0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心2min,取上清液 200μL 于 1.5mL 滅菌離心管中;病樣組織直接上機提取也有實驗室在用(江蘇泰州農(nóng)委)
2.1.2全血樣本:取全血離心后的上清(血清) 200μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
相關實驗設備:動物組織研磨儀、手持式電動組織研磨儀
根據(jù)樣本數(shù)量多少可用高通量組織破碎儀或者手持式組織研磨儀破碎組織樣本,之后用離心機將樣本離心分層,取上清液。
2.2樣本保存和運輸
上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個月,標本運送應采用 藍冰和干冰運輸,嚴禁反復凍融。
 
2.3 DNA 提取
對上述處理好的標本加入到預裝好提取試劑的96深孔板中,將加好樣本的耗材放置到96全自動核酸提取儀中提取核酸。

96全自動核酸提取儀用于病毒核酸的提取,配套提取試劑可以以散裝形式提供,也可以以預裝的形式提供,96高通量移液工作站可以用于散裝試劑的分裝。
 
3. 試劑配制(試劑準備區(qū))
根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照;樣品每滿 7 份,多配制 1 份),將上游引物、下游引物、熒光定量探針、酶液預混好,將混合好反應液分裝到 PCR 反應管中。舉例如下:
根據(jù)樣本的多少可以選用96高通量移液工作站或移液排槍進行體系的配置和分裝。
 
4. 加樣(樣本處理區(qū))
將提取的 DNA、陽性質控品、陰性質控品各取一定量,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
                                                              
5. PCR 擴增(核酸擴增區(qū))
5.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi);
5.2 設置好通道、樣品信息,反應體系設置為 20μL;
熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。
5.3 相關設備:
BTK-6 熒光PCR儀、BTK-10 超快速熒光PCR儀、ABI7500、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
6. 結果分析判定
按照非洲豬瘟核酸檢測試劑盒指導進行判讀。

發(fā)布者:無錫百泰克生物技術有限公司
聯(lián)系電話:18001279873
E-mail:info@bioteke.cn

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