引言

蝦青素被稱為“抗氧化之王”，其抗氧化能力是維生素的550倍，兼具抗癌、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)心血管等多重功效。

天然提取蝦青素需消耗大量水資源和土地且產(chǎn)量有限，而生物合成面臨規(guī)�；�生產(chǎn)的問(wèn)題。預(yù)計(jì)全球蝦青素市場(chǎng)到2030年供需缺口將達(dá)1-1.5萬(wàn)噸，中國(guó)缺口約3,000-5,000噸。如何提升生物合成蝦青素效率成為填補(bǔ)缺口的關(guān)鍵。

圖1.紅發(fā)夫酵母結(jié)晶紫染色后的光鏡圖

本實(shí)驗(yàn)采用野生型的紅法夫酵母，相較于基因編輯菌，野生菌在天然構(gòu)型安全性、市場(chǎng)合規(guī)性上更具競(jìng)爭(zhēng)力，但通常野生型菌株的產(chǎn)量較低。

發(fā)酵設(shè)備使用高通量平行生物反應(yīng)器+一次性罐體的工藝系統(tǒng)組合，進(jìn)行工藝參數(shù)的快速優(yōu)化，最終在培養(yǎng)溫度20℃，pH 4.5，發(fā)酵119h后蝦青素含量達(dá)到了327.73mg/L，蝦青素的含量提高了7.6 倍，培養(yǎng)周期縮短了70h（預(yù)實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基優(yōu)化篩選中發(fā)酵189h,蝦青素含量42.91mg/L）。驗(yàn)證了這套系統(tǒng)能夠用于野生紅法夫酵母菌株高產(chǎn)蝦青素的快速優(yōu)化培養(yǎng)。

材料與方法

菌株：
紅法夫酵母：菌株編號(hào)GDMCC 2.218；
來(lái)源：廣東省微生物菌種保藏中心。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：
CloudReady^® + Endura SUB^® 0.5L 一次性罐體×8-（迪必爾生物）；Arc HPLC（Waters）

圖2.CloudReady^®云平臺(tái)生物反應(yīng)器8聯(lián)（一次性罐體）

軟件系統(tǒng)：
D2MS(設(shè)備和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng), Device & Data management system）Pro

實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所：
迪必爾生物 應(yīng)用技術(shù)與工程研究中心（CARE）

實(shí)驗(yàn)過(guò)程

培養(yǎng)基：
初始培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基，由預(yù)實(shí)驗(yàn)（培養(yǎng)189h，蝦青素產(chǎn)量為42.91mg/L）結(jié)果優(yōu)化獲得。如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基

工藝條件設(shè)置：
（1）溫度梯度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
首先選用4臺(tái)CloudReady^® 預(yù)先進(jìn)行溫度梯度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，4個(gè)反應(yīng)器分別標(biāo)記為R1a，R2a，R3a，R4a。具體各罐臺(tái)參數(shù)條件設(shè)置如下表所示。

表2 溫度梯度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)工藝參數(shù)設(shè)置

（2）pH梯度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
選用另4臺(tái)CloudReady^®進(jìn)行pH梯度的優(yōu)化，四個(gè)罐臺(tái)分別標(biāo)記為R1，R2，R3，R4。

為了縮短優(yōu)化周期，在初次預(yù)設(shè)值的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到了第3d的時(shí)候，繼續(xù)本次實(shí)驗(yàn)測(cè)試，為節(jié)約準(zhǔn)備時(shí)間罐體采用一次性罐體（如圖3所示）。具體各罐臺(tái)參數(shù)條件設(shè)置如表3所示。

圖3.Endura SUB^® 一次性罐體

表3 pH梯度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)工藝參數(shù)設(shè)置

蝦青素測(cè)定方法：
（1）紅法夫酵母蝦青素的處理，選用酸熱法^[2]。
（2）紅法夫酵母蝦青素的分析：采用HPLC法進(jìn)行分析測(cè)試^[3]。

液相設(shè)備：色譜條件為Waters XBridge^® C18柱 (4.6×50mm)；流動(dòng)相為甲醇-水(95:5)；流速為1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為475nm。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
（1）溫度梯度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
按照表1的工藝條件設(shè)計(jì)， 如圖4所示，R1a和R2a罐臺(tái)菌體生長(zhǎng)緩慢，在培養(yǎng)到46.4h的時(shí)候下罐放棄培養(yǎng)。R3a和R4a罐臺(tái)繼續(xù)培養(yǎng)到168h后放罐。如圖5所示，其中R3a罐臺(tái)在培養(yǎng)到118h有最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，OD₆₀₀ 24.84，其中蝦青素的含量為88.76mg/L,比預(yù)實(shí)驗(yàn)的蝦青素的含量提高了，培養(yǎng)周期縮短了71h（預(yù)實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基優(yōu)化篩選中, 發(fā)酵189h,蝦青素含量42.91mg/L）。

圖4.R1a-R4a罐臺(tái)批次生長(zhǎng)曲線

圖5.R1a-R4a蝦青素的生長(zhǎng)曲線

（2）pH梯度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
按照表2的工藝條件設(shè)計(jì)，如圖6所示，其中R1罐臺(tái)在pH3.5的條件下菌體生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)到46h后做放罐處理。其它罐臺(tái)生長(zhǎng)正常，繼續(xù)培養(yǎng)到144h，如圖7所示，其中R3罐臺(tái)在培養(yǎng)到119h有最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，OD₆₀₀ 35.8，濕重84.1g/L，其中蝦青素的含量為327.73mg/L，在短時(shí)間優(yōu)化后快速的將蝦青素的含量提高了7.6倍，培養(yǎng)周期縮短了70h（預(yù)實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基優(yōu)化篩選中, 發(fā)酵189h,蝦青素含量42.91mg/L）。

圖6.R1-R4批次生長(zhǎng)曲線
圖7.R1-R4罐臺(tái)蝦青素生產(chǎn)曲線

（3）如圖8所示，隨著培養(yǎng)過(guò)程的進(jìn)行，蝦青素的含量也在快速的生產(chǎn)，發(fā)酵菌液的顏色也由淺黃色慢慢的變成深紅色。

圖8.蝦青素生產(chǎn)的罐體局部放大圖

總結(jié)
本次研究利用了CloudReady^®云平臺(tái)生物反應(yīng)器高通量平行、智能化、可拓展的優(yōu)勢(shì)，以及Endura SUB^®一次性罐體與玻璃罐高度一致性、顯著提升工藝開(kāi)發(fā)和優(yōu)化效率的特點(diǎn)，在21天的時(shí)間里實(shí)現(xiàn)了蝦青素產(chǎn)量7.6倍的提升。

未來(lái)，隨著菌株改造、智能算法優(yōu)化（AI動(dòng)態(tài)調(diào)控）的深化，蝦青素生產(chǎn)成本有望進(jìn)一步降低，推動(dòng)其在食品、醫(yī)藥、護(hù)膚等領(lǐng)域的規(guī)�；瘧�(yīng)用。

參考文獻(xiàn)
[1] 姜文濤,韓麗影,等. 產(chǎn)蝦青素紅法夫酵母的發(fā)酵工藝優(yōu)化[J]. 飼料博覽,2021, 12: 13-18.
[2] 李賢宇,肖冬光. 紅法夫酵母細(xì)胞內(nèi)蝦青素的提取方法研究[C].2005年工業(yè)微生物研討會(huì)，2005:501-506.
[3] 饒毅,曾戀情,等.高效液相法測(cè)定蝦青素的含量[J].江西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2014,26(5):86-88.

注：本文實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及圖片版權(quán)歸迪必爾生物工程（上海）有限公司所有，未經(jīng)授權(quán)禁止轉(zhuǎn)載。
原文作者：應(yīng)用技術(shù)與工程研究中心（CARE）石興利。