m5C RNA甲基化測(cè)序（m5C MeRIP-seq）技術(shù)介紹與應(yīng)用
m5C是RNA百余種修飾中研究較多的一種。m5C存在于tRNA上時(shí)，可以對(duì)翻譯進(jìn)行調(diào)節(jié)；存在于rRNA上時(shí)，可以對(duì)核糖體的生物合成進(jìn)行質(zhì)控；存在于mRNA上時(shí)，則可以影響mRNA的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性及翻譯過(guò)程。
m5C RNA修飾的檢測(cè)，易基因采用基于抗體富集的甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序方法（m5C MeRIP-seq），該技術(shù)利用m5C特異性抗體富集發(fā)生m5C修飾的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），結(jié)合高通量測(cè)序，對(duì)RNA上的m5C修飾進(jìn)行定位與定量，總RNA起始量可降低至10μg，最低僅需1μg總RNA。
適用于不同科研需求的m5C-seq技術(shù)：
RNA樣品→文庫(kù)構(gòu)建→上機(jī)測(cè)序→數(shù)據(jù)分析
實(shí)驗(yàn)策略：
分析內(nèi)容：
送樣要求：
典型案例
NSUN2介導(dǎo)的m5C RNA甲基化通過(guò)促進(jìn)PFAS mRNA穩(wěn)定性和表達(dá)來(lái)決定視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的進(jìn)展
NSUN2-mediated m5C RNA methylation dictates retinoblastoma progression through promoting PFAS mRNA stability and expression
背景
NSUN2介導(dǎo)的N5-甲基胞嘧啶（m5C）修飾通過(guò)激活癌基因或抑制腫瘤抑制因子參與多種腫瘤的細(xì)胞增殖和侵襲。m5C在RNA代謝中起重要作用，對(duì)于維持表觀基因組穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。然而，m5C修飾在致癌過(guò)程中的作用尚未完全明確。
方法
本研究通過(guò)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（RB）細(xì)胞和臨床樣品中的mRNA分離和抗m5C dot blot試驗(yàn)檢測(cè)全局和mRNA m5C水平。建立原位眼內(nèi)異種移植模型以檢查RB的致癌行為，并進(jìn)行全基因組多組學(xué)分析以鑒定NSUN2的功能靶標(biāo)，包括蛋白質(zhì)組學(xué)分析，轉(zhuǎn)錄組篩選和m5C甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（m5C meRIP-seq）。此外進(jìn)行了基于類器官的單細(xì)胞分析和基因相關(guān)性分析，以驗(yàn)證NSUN2/ALYREF/m5C PFAS致癌級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
結(jié)果
研究結(jié)果表明，NSUN2介導(dǎo)的m5C RNA甲基化在RB的致癌過(guò)程中促進(jìn)嘌呤的生物合成。
圖：m5C meRIP-seq鑒定NSUN2的潛在RNA靶標(biāo)
參考文獻(xiàn)：
Zuo S,et al.NSUN2-mediated m5 C RNA methylation dictates retinoblastoma progression through promoting PFAS mRNA stability and expression. Clin Transl Med. 2023 May;13(5):e1273. doi: 10.1002/ctm2.1273.
m5C RNA修飾的檢測(cè)，易基因采用基于抗體富集的甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序方法（m5C MeRIP-seq），該技術(shù)利用m5C特異性抗體富集發(fā)生m5C修飾的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），結(jié)合高通量測(cè)序，對(duì)RNA上的m5C修飾進(jìn)行定位與定量，總RNA起始量可降低至10μg，最低僅需1μg總RNA。
適用于不同科研需求的m5C-seq技術(shù)：
- m5C甲基化-常量mRNA 甲基化測(cè)序（m5C-seq）
- m5C甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化測(cè)序（lnc-m5C-seq）
- m5C甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化測(cè)序（Micro-lnc-m5C-seq）
- 起始量低：樣本起始量可降低至10-20μg，最低僅需1μg總RNA；
- 轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)：可以同時(shí)檢測(cè)mRNA和lncRNA；
- 樣本要求：可用于動(dòng)物、植物、細(xì)胞及組織的m5C檢測(cè)；
- 重復(fù)性高：IP富集重復(fù)性高，最大化降低抗體富集偏差
- 應(yīng)用范圍廣：廣泛應(yīng)用于組織發(fā)育、干細(xì)胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷應(yīng)答、癌癥的發(fā)生與發(fā)展、藥物應(yīng)答等研究領(lǐng)域。
RNA樣品→文庫(kù)構(gòu)建→上機(jī)測(cè)序→數(shù)據(jù)分析
實(shí)驗(yàn)策略：
分析內(nèi)容：
送樣要求：
典型案例
NSUN2介導(dǎo)的m5C RNA甲基化通過(guò)促進(jìn)PFAS mRNA穩(wěn)定性和表達(dá)來(lái)決定視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的進(jìn)展
NSUN2-mediated m5C RNA methylation dictates retinoblastoma progression through promoting PFAS mRNA stability and expression
背景
NSUN2介導(dǎo)的N5-甲基胞嘧啶（m5C）修飾通過(guò)激活癌基因或抑制腫瘤抑制因子參與多種腫瘤的細(xì)胞增殖和侵襲。m5C在RNA代謝中起重要作用，對(duì)于維持表觀基因組穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。然而，m5C修飾在致癌過(guò)程中的作用尚未完全明確。
方法
本研究通過(guò)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（RB）細(xì)胞和臨床樣品中的mRNA分離和抗m5C dot blot試驗(yàn)檢測(cè)全局和mRNA m5C水平。建立原位眼內(nèi)異種移植模型以檢查RB的致癌行為，并進(jìn)行全基因組多組學(xué)分析以鑒定NSUN2的功能靶標(biāo)，包括蛋白質(zhì)組學(xué)分析，轉(zhuǎn)錄組篩選和m5C甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（m5C meRIP-seq）。此外進(jìn)行了基于類器官的單細(xì)胞分析和基因相關(guān)性分析，以驗(yàn)證NSUN2/ALYREF/m5C PFAS致癌級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
結(jié)果
研究結(jié)果表明，NSUN2介導(dǎo)的m5C RNA甲基化在RB的致癌過(guò)程中促進(jìn)嘌呤的生物合成。
- 與正常視網(wǎng)膜相比，RBs中的全局和mRNA m5C水平顯著富集。
- 在RB樣品和細(xì)胞系中NSUN2的腫瘤特異性表達(dá)增加。
- 在治療上，NSUN2的靶向校正在體外和體內(nèi)均對(duì)RB中表現(xiàn)出有效的治療功效。
- 通過(guò)多組學(xué)分析，鑒定出嘌呤生物合成中的重要磷酸核糖甲酰甘氨酸脒合酶（PFAS）是NSUN2的下游候選靶標(biāo)。PFAS的重新引入在很大程度上逆轉(zhuǎn)了NSUN2缺陷型RB細(xì)胞的抑制表型，表明PFAS是NSUN2的功能性下游靶標(biāo)。
- m5C reader蛋白ALYREF負(fù)責(zé)識(shí)別PFAS的m5C修飾，通過(guò)增強(qiáng)其RNA穩(wěn)定性來(lái)增加其表達(dá)。
圖：m5C meRIP-seq鑒定NSUN2的潛在RNA靶標(biāo)
參考文獻(xiàn)：
Zuo S,et al.NSUN2-mediated m5 C RNA methylation dictates retinoblastoma progression through promoting PFAS mRNA stability and expression. Clin Transl Med. 2023 May;13(5):e1273. doi: 10.1002/ctm2.1273.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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