優(yōu)化細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：讓異質(zhì)細(xì)胞樣本數(shù)據(jù)更可靠的方法
Cell-based assays（CBA）為獲取復(fù)雜且與生物學(xué)相關(guān)的數(shù)據(jù)鋪平了道路。它們可用于量化復(fù)合物的細(xì)胞毒性、生化機(jī)制、生物活性和非靶標(biāo)相互作用——在某些情況下甚至可以同時(shí)進(jìn)行。然而，CBA的巨大潛力可能需要更多的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和準(zhǔn)備工作。在測(cè)量CBA時(shí)，通常會(huì)有一些額外的考慮，而傳統(tǒng)的生化檢測(cè)則不會(huì)遇到這些問(wèn)題。這些考慮可能包括檢測(cè)實(shí)施和評(píng)估方面的差異。本文將重點(diǎn)介紹CBA中可能面臨的一些障礙，并提出一些克服障礙的方法。
圖1：微孔板中的貼壁細(xì)胞代表異質(zhì)性樣本。使用BMG LABTECH的Atmospheric Control Unit（ACU）時(shí)，除了可用的溫度控制外，您還可以控制讀數(shù)器內(nèi)的CO₂和O₂氣體濃度。這可以將您的酶標(biāo)儀轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞培養(yǎng)箱，并可以在保持細(xì)胞活力的前提下進(jìn)行為期幾天的活細(xì)胞動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，從而使基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具生理學(xué)意義。
在本文中，我們將仔細(xì)研究基于細(xì)胞的檢測(cè)的異質(zhì)性。我們將強(qiáng)調(diào)許多細(xì)胞樣本的異質(zhì)性所帶來(lái)的問(wèn)題，并提供一些潛在的解決方案和工具。大多數(shù)體外細(xì)胞培養(yǎng)物在進(jìn)行微孔板讀數(shù)時(shí)都是異質(zhì)性樣本，不過(guò)也有一些基于細(xì)胞的檢測(cè)方法，如 alamarBlue™ 或 CellTiter-Glo® ，上清液中的染料是均一的。如圖1所示，貼壁細(xì)胞只能形成薄薄的一層。在異質(zhì)CBA中測(cè)量細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)或細(xì)胞膜上的靶標(biāo)時(shí)，與均質(zhì)液體樣本相比，需要考慮更多因素。
焦距高度
最佳焦距是指酶標(biāo)儀可以探測(cè)樣品最高信號(hào)強(qiáng)度的平面。如果測(cè)量樣品時(shí)焦距不當(dāng)，會(huì)對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。大多數(shù)體外細(xì)胞模型都依賴(lài)于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞通常在微孔板孔的平面底部培養(yǎng)。為了便于細(xì)胞附著，微孔板材料通常經(jīng)過(guò)處理，使其表面生成極性基團(tuán)，或者涂覆細(xì)胞天然細(xì)胞外基質(zhì)的成分。細(xì)胞單層的探測(cè)存在一個(gè)問(wèn)題：酶標(biāo)儀上的探測(cè)高度必須與樣品的焦平面對(duì)齊，以提供最大的信號(hào)。BMG LABTECH軟件會(huì)自動(dòng)生成焦距高度曲線，以圖形方式顯示不同焦距下的信號(hào)強(qiáng)度（圖2）。如圖所示，如果焦距偏離最佳焦距哪怕只有一毫米，熒光強(qiáng)度就會(huì)迅速下降。
圖2：讀數(shù)器控制軟件提供的不同焦距高度下的信號(hào)強(qiáng)度曲線。另一方面，當(dāng)探測(cè)的焦平面過(guò)多地進(jìn)入細(xì)胞上方的溶液時(shí)，信噪比（S/B）才會(huì)降低（圖3）。在無(wú)法確定的情況下，建議使用較低的焦距高度，而不是較高的焦距高度。在BMG LABTECH酶標(biāo)儀上，當(dāng)從微孔板上方或下方讀取時(shí)，焦距可以調(diào)整和優(yōu)化，這意味著用戶(hù)可始終受益于使用最佳焦距所帶來(lái)的檢測(cè)質(zhì)量的提高。
圖3：信噪比（S/B）取決于所使用的焦距高度。通過(guò)底部光學(xué)器件在不同焦距高度下測(cè)量孔，并從不同焦距高度的熒光信號(hào)強(qiáng)度中計(jì)算S/B。在開(kāi)始測(cè)量前，建議先進(jìn)行焦距調(diào)整。理想情況下，在細(xì)胞數(shù)量多且預(yù)期信號(hào)高的孔中進(jìn)行焦距調(diào)整。如果您知道信號(hào)強(qiáng)度和S/B比通常較低，請(qǐng)?jiān)跍y(cè)量前額外接種一個(gè)孔，并用PBS覆蓋，以最大限度地提高可用的S/B比。使用該孔進(jìn)行焦距調(diào)整。
由于貼壁細(xì)胞位于微孔板的底部，因此焦距的最佳值應(yīng)在0至3毫米之間。單個(gè)焦距取決于所使用的微孔板及其底層的厚度。
孔掃描的重要性
貼壁細(xì)胞除了在培養(yǎng)基的 Z 平面上有明顯的分布外，通常在 X/Y 平面上也有不同的分布。如果只從中間進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果可能會(huì)嚴(yán)重失真。細(xì)胞可以分布在培養(yǎng)基底的任何位置，而且在大多數(shù)情況下分布不均。特別是在細(xì)胞密度較低或只有亞群包含目標(biāo)時(shí)，很可能整個(gè)孔的細(xì)胞信號(hào)通路分布不均。通常情況下，微孔板測(cè)量是在每個(gè)孔的中心進(jìn)行的。
在 BMG LABTECH 微孔板酶標(biāo)儀上進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)熒光測(cè)量時(shí)，每孔中心會(huì)有 20 次閃爍，然后讀取相應(yīng)的發(fā)射值。結(jié)果為這 20 個(gè)測(cè)量點(diǎn)的平均值。細(xì)胞可能不會(huì)均勻分布在孔表面。例如，它們可能并不集中在孔的中心，而在邊緣沉積。如果只從中間測(cè)量熒光表達(dá)細(xì)胞，結(jié)果可能會(huì)嚴(yán)重失真。為了解決這個(gè)問(wèn)題，BMG LABTECH 為其酶標(biāo)儀提供了不同的孔掃描選項(xiàng)。除了在孔中心進(jìn)行傳統(tǒng)的測(cè)量外，還可將單個(gè)測(cè)量點(diǎn)以軌道或螺旋掃描模式遍布整個(gè)孔底 (圖 4)
圖4：BMG LABTECH的孔掃描選項(xiàng)包括軌道、螺旋和矩陣掃描以及中心測(cè)量。這樣，整個(gè)孔表面可以覆蓋多個(gè)測(cè)量點(diǎn)，從而獲得更可靠、更具代表性的測(cè)量結(jié)果，并提高重復(fù)測(cè)量之間的可再現(xiàn)性。此外，矩陣掃描選項(xiàng)可根據(jù)數(shù)據(jù)點(diǎn)矩陣對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行多次測(cè)量。這提供了整個(gè)孔內(nèi)信號(hào)的局部分辨率，從而提供了監(jiān)測(cè)接種均勻性和目標(biāo)信號(hào)局部變化的機(jī)會(huì)。使用矩陣掃描選項(xiàng)時(shí)，讀數(shù)器在每個(gè)孔中進(jìn)行多次測(cè)量，分辨率高達(dá)900點(diǎn)/孔（30 x 30數(shù)據(jù)點(diǎn)矩陣）。BMG LABTECH的軟件可以以圖形方式顯示每個(gè)掃描點(diǎn)，為每個(gè)孔創(chuàng)建3D熱圖。
如果細(xì)胞密集且分布均勻，則中間讀取和掃描選項(xiàng)都能獲得相似的結(jié)果。然而，如果樣品不均勻，則可以使用掃描選項(xiàng)來(lái)補(bǔ)償孔內(nèi)的任何變化。圖 5 顯示了表達(dá)綠色熒光蛋白 (GFP) 的苔蘚細(xì)胞的矩陣掃描。該掃描顯示了孔內(nèi)信號(hào)或細(xì)胞的異質(zhì)分布，如果只在孔中心進(jìn)行測(cè)量，則無(wú)法檢測(cè)到這種異質(zhì)分布。矩陣掃描功能還能讓您從評(píng)估中排除單個(gè)點(diǎn)或整個(gè)區(qū)域。
圖5：使用25 x 25矩陣掃描和底部光學(xué)元件獲得的GFP表達(dá)苔蘚細(xì)胞的矩陣掃描。顏色表示信號(hào)強(qiáng)度，從低（紫色和藍(lán)色）到高（紅色）。圖6顯示了使用孔中心和掃描選項(xiàng)測(cè)量的10個(gè)重復(fù)。當(dāng)使用所有掃描選項(xiàng)時(shí)，變異系數(shù)（以%CV表示）會(huì)大大降低，而矩陣掃描可獲得最佳結(jié)果。由于螺旋平均法可以覆蓋更大的孔區(qū)，因此與軌道平均法相比，數(shù)據(jù)會(huì)略有改善。
圖6：孔掃描可降低數(shù)據(jù)變異系數(shù)（%CV）。使用底部光學(xué)器件和不同的孔掃描選項(xiàng)測(cè)量細(xì)胞。每個(gè)掃描選項(xiàng)均顯示孔中心測(cè)量數(shù)據(jù)的變異系數(shù)（%CV）降低。結(jié)論
異質(zhì)細(xì)胞樣品的熒光測(cè)量主要建議總結(jié)如下：
- 處理貼壁細(xì)胞時(shí)一定要調(diào)整焦距。
- 貼壁CBA通常受益于孔掃描模式的應(yīng)用，以校正孔中異質(zhì)信號(hào)分布。
- 矩陣掃描功能可讓您獲得整個(gè)孔內(nèi)信號(hào)的局部分辨率，從而有機(jī)會(huì)監(jiān)測(cè)接種的均勻性和目標(biāo)信號(hào)的局部變化。
- 矩陣掃描功能還使您能夠從評(píng)估中排除單個(gè)點(diǎn)或整個(gè)區(qū)域。
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