icIEF-native MS聯(lián)用技術(shù)在cys-ADC電荷異質(zhì)性分析中重要應(yīng)用
摘要
本文中展示了2024年9月中檢院單抗室最新發(fā)表在Electrophoresis 和 Journal of Chromatography A期刊上的兩篇文章[1-2]，分別對多個半胱氨酸偶聯(lián)的抗體-藥物偶聯(lián)物（cysteine-conjugated antibody-drug conjugate, cys-ADC）進行表征，尤其是電荷異質(zhì)性分析的研究結(jié)果。
前言
這兩篇文章均以cys-ADC作為研究對象。該類產(chǎn)品是通過一個可裂解的連接子將具有細胞毒性的藥物偶聯(lián)至單克隆抗體上，通過單克隆抗體精準(zhǔn)識別靶細胞（通常為癌細胞）后，整個ADC分子被內(nèi)吞進細胞，隨后連接子在胞內(nèi)裂解，釋放出細胞毒性藥物，從而實現(xiàn)精準(zhǔn)殺滅靶細胞的目的，同時最大程度上減小高細胞毒性藥物可能給病人帶來的副作用。對于本文中所討論的cys-ADC，在偶聯(lián)過程中，單抗輕重鏈間的二硫鍵被部分還原，暴露出的自由巰基用于小分子藥物偶聯(lián)，輕重鏈間僅靠非共價力相互結(jié)合，故能夠保持分子內(nèi)非共價相互作用的非變性質(zhì)譜（native MS）技術(shù)被廣泛應(yīng)用在cys-ADC的表征中。
工作亮點
這兩篇文章的突出亮點在于成像等電聚焦毛細管電泳 (Imaged Capillary Isoelectric Focusing, icIEF)和非變性質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用對于揭示cys-ADC電荷異質(zhì)性的重要性。
對于cys-ADC產(chǎn)品，其單抗包含多種翻譯后修飾，如糖基化、脫酰胺和氧化等，再加上小分子藥物的偶聯(lián)，異質(zhì)性極高，傳統(tǒng)的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對其電荷變異體的分離程度有限。而icIEF技術(shù)由于分離原理不同，可以從另一個角度對ADC進行最大程度上的電荷異質(zhì)體分離，隨后使用基于Orbitrap平臺的高靈敏度非變性質(zhì)譜技術(shù)對各個電荷異質(zhì)峰進行在線完整蛋白分子量測定。
結(jié)果與討論
研究人員首先使用NISTmAb標(biāo)準(zhǔn)品進行了icIEF native MS方法開發(fā)，工作流程如圖1所示。Advanced Electrophoresis Solutions Ltd. （AES）公司的CEInfinite Automated Preparative icIEF System與Thermo Scientific™ Orbitrap™ Exploris™ 240 超高分辨質(zhì)譜儀被用于icIEF native MS分析。該icIEF系統(tǒng)可同時實現(xiàn)分析型/直連型/離線餾分收集功能，與質(zhì)譜直連非常靈活，不需要額外購買單獨的離子源接口。AEstyle系列兩性電解質(zhì)可實現(xiàn)超高分辨率的電荷異質(zhì)體分離，且對質(zhì)譜的污染小。Orbitrap Exploris 240 超高分辨質(zhì)譜儀的高靈敏度和高質(zhì)量精度有助于發(fā)現(xiàn)并準(zhǔn)確鑒定低豐度的組分，這一點對于非變性質(zhì)譜條件下的完整分子量分析尤為關(guān)鍵，因為相較于變性質(zhì)譜，非變性質(zhì)譜條件下蛋白的帶電量減少，質(zhì)譜響應(yīng)降低。
圖1. icIEF native MS 整體工作流程
圖2展示了使用 icIEF native MS流程對NISTmAb分析的icIEF-UV分離譜圖、質(zhì)譜總離子流（TIC）圖和部分電荷異質(zhì)峰的原始譜圖及解卷積結(jié)果。如圖2A所示，NISTmAb的電荷異質(zhì)峰在icIEF層面上得到了分離，隨之被直連的質(zhì)譜檢測到（圖2B）。從圖2C展示的主峰及部分酸/堿峰原始譜圖不難發(fā)現(xiàn)，對于高豐度的主峰和低豐度的酸/堿峰，均可在非變性條件下獲得高信噪比的原始譜圖，數(shù)據(jù)的高質(zhì)量毋庸置疑。圖2D為圖2C中原始數(shù)據(jù)的解卷積結(jié)果，可見各個電荷異質(zhì)峰中的組分均可得到解析，同時兼具高質(zhì)量精度（主峰中A2G0F+A2G1F， 實測值與理論值質(zhì)量偏差僅為0.9ppm）。更多詳細信息可參閱原文[1]。
圖2A. icIEF native MS條件下NISTmAb的icIEF-UV分離譜圖。
圖2B. icIEF native MS條件下NISTmAb的icIEF-MS質(zhì)譜總離子流(TIC)圖。
圖2C. icIEF native MS條件下NISTmAb的主峰/酸峰1/堿峰3一級質(zhì)譜圖。
圖2D. icIEF native MS條件下NISTmAb的主峰/酸峰1/堿峰3解卷積譜圖。
圖3分別展示了使用 icIEF native MS流程對兩個cys-ADC 維迪西妥[2]和維泊妥珠[1]進行電荷異質(zhì)性分析的結(jié)果。在icIEF層面上，兩個cys-ADC均得到了分離，隨后的native MS直連結(jié)果表明，兩個ADC電荷異質(zhì)峰的分布略有差異，可能是由于兩個ADC分子各自的理化性質(zhì)不同所導(dǎo)致的，進一步證明了ADC分子的復(fù)雜性和對其進行深入表征的必要性。詳細結(jié)果可參閱原文[1-2]。
本文所介紹的工作中，所使用的軟件也值得關(guān)注：Thermo Scientific™ Chromeleon™ Chromatography Data System (CDS) Software 被用于icIEF和Orbitrap超高分辨質(zhì)譜平臺的儀器控制及數(shù)據(jù)采集[1]，為客戶的日常實驗提供了極大便利，同時也可以滿足客戶對于軟件合規(guī)性的需求。
本文所介紹的工作中，所使用的軟件也值得關(guān)注：Thermo Scientific™ Chromeleon™ Chromatography Data System (CDS) Software 被用于icIEF和Orbitrap超高分辨質(zhì)譜平臺的儀器控制及數(shù)據(jù)采集[1]，為客戶的日常實驗提供了極大便利，同時也可以滿足客戶對于軟件合規(guī)性的需求。
圖3A. icIEF native MS條件下維迪西妥的icIEF-UV分離圖（左）和icIEF-MS質(zhì)譜總離子流(TIC)圖（右）。
圖 3B. icIEF native MS條件下維迪西妥各個電荷異質(zhì)峰的解卷積圖。
圖3C. icIEF native MS條件下維泊妥珠的icIEF-UV分離圖（左）和icIEF-MS質(zhì)譜總離子流(TIC)圖（右）。
圖 3D. icIEF native MS條件下維泊妥珠各個電荷異質(zhì)峰的解卷積圖。結(jié)論
本文所介紹的兩篇文章強調(diào)了創(chuàng)新型 icIEF-native MS 技術(shù)在 cys-ADC電荷異質(zhì)性分析中的重要貢獻。該技術(shù)可被廣泛應(yīng)用于具有非共價相互作用分子的電荷異質(zhì)性分析中，提供全面的完整分子量信息用于組分鑒定。對于有合規(guī)需求的客戶，變色龍軟件的使用可滿足客戶要求。
原文參考鏈接：
[1] https://doi.org/10.1002/elps.202400083
[2] https://doi.org/10.1016/j.chroma.2024.465353
原文參考鏈接：
[1] https://doi.org/10.1002/elps.202400083
[2] https://doi.org/10.1016/j.chroma.2024.465353
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