本文原創(chuàng)：張慶峰 本文來源：愛迪爾筆記

嵌合抗原受體T細胞（CAR T）療法屬于過繼性T細胞療法，其概念源于20世紀80年代，最初由以色列科學家Eshhar等人提出，通過將抗體的抗原識別域與T細胞受體結合，使T細胞能夠特異性識別并攻擊腫瘤細胞。

經(jīng)過幾代技術的迭代，CAR T細胞不斷優(yōu)化，從單一信號到多信號共刺激，再到分泌細胞因子增強功能，如今已成為治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的重要手段，并在實體瘤治療中展現(xiàn)出巨大潛力。

1.1 什么是Adoptive T-cell therapy（過繼性T細胞療法）？
過繼性T細胞療法（Adoptive T-cell therapy, ACT）是一種利用患者自身T細胞來治療惡性腫瘤的細胞免疫療法。ACT的核心是將患者體內的T細胞分離出來，在體外進行擴增、基因改造或激活，以增強其抗腫瘤能力，然后再回輸?shù)交颊唧w內。ACT主要包括以下幾種方法：

1. 腫瘤浸潤性淋巴細胞（TILs）：從腫瘤組織中分離出的T細胞，經(jīng)過體外擴增后回輸。
2. 嵌合抗原受體T細胞（CAR T細胞）：通過基因工程技術將CAR導入T細胞，使其能夠特異性識別腫瘤細胞表面的抗原。
3. 轉基因腫瘤特異性T細胞受體T細胞（TCR T細胞）：通過基因改造使T細胞表達特異性識別腫瘤抗原的TCR。

1.2 Principles of CAR T cells（CAR T細胞的原理）
1.2.1 Structure（結構）
嵌合抗原受體（Chimeric Antigen Receptor, CAR）是一種通過基因工程技術將不同受體的結構域組合而成的人工受體。CAR的結構主要包括以下幾個部分：

• 細胞外抗原識別域：通常來源于單克隆抗體的單鏈可變片段（scFv），能夠以非MHC限制性的方式識別腫瘤細胞表面的抗原。這種非限制性識別方式是CAR T細胞的一大優(yōu)勢，因為許多腫瘤細胞會下調MHC I類分子的表達以逃避免疫監(jiān)視。
• 鉸鏈區(qū)：連接抗原識別域和跨膜域，為CAR的表達和抗原結合功能提供靈活性。鉸鏈區(qū)的長度會影響免疫突觸的形成，進而影響CAR T細胞的功能。
• 跨膜區(qū)：將CAR錨定在細胞膜上，其序列通常來源于CD4、CD8或CD28等分子�？缒�區(qū)的結構會影響CAR的二聚化，從而可能影響其信號傳導。
• 細胞內信號傳導區(qū)：包含CD3ζ鏈和共刺激信號域（如CD28、4-1BB等）。CD3ζ鏈含有三個免疫受體酪氨酸基激活基序（ITAMs），在被磷酸化后能夠招募激酶并啟動TCR信號傳導級聯(lián)反應。共刺激信號域則通過PI3K/Akt、MAPK等信號通路影響T細胞的激活、細胞毒性、增殖、持久性、代謝活性和細胞因子分泌等功能。

1.2.2 CAR signaling（CAR信號傳導）
CAR T細胞的激活機制類似于TCR信號傳導。當CAR的抗原識別域與靶抗原結合時，CAR會發(fā)生多聚化并模擬TCR信號傳導。CD3ζ鏈上的ITAMs被Src家族激酶LCK磷酸化后，招募ZAP70等下游信號分子，進而激活LAT、PLC-γ等信號通路，最終導致NFκB、AP-1和NFAT等轉錄因子的激活。與TCR信號傳導不同的是，CAR信號傳導中CD28和4-1BB等共刺激信號域的激活方式也存在差異。CD28信號域的激活依賴于LCK，而4-1BB信號域則與LCK的結合較弱。這種差異導致了兩種CAR T細胞在早期激活信號強度、細胞因子分泌、細胞毒性功能和持久性等方面的不同表現(xiàn)。

1.2.3 Mechanism of action（作用機制）
CAR T細胞通過多種機制發(fā)揮抗腫瘤作用：

• 直接細胞毒性：CAR T細胞識別并結合靶細胞后，通過釋放穿孔素和顆粒酶（如顆粒酶B）誘導靶細胞凋亡。此外，CAR T細胞還可以通過Fas-FasL軸介導靶細胞死亡。
• 細胞因子分泌：CAR T細胞激活后會分泌多種細胞因子，如TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6等。這些細胞因子不僅能夠增強CAR T細胞的抗腫瘤活性，還可以激活和招募其他免疫細胞（如NK細胞、B細胞和巨噬細胞）參與抗腫瘤反應。然而，細胞因子的大量分泌也可能導致細胞因子釋放綜合征（CRS）等嚴重的不良反應。
• 間接抗腫瘤作用：CD4+ CAR T細胞通過分泌IFN-γ等細胞因子激活巨噬細胞，增強其吞噬功能，并上調腫瘤細胞表面的MHC I類分子表達，從而增強腫瘤細胞對免疫系統(tǒng)的敏感性。此外，IFN-γ還可以通過上調腫瘤細胞表面的Fas受體表達，增強CAR T細胞的Fas-FasL介導的細胞毒性作用。

1.3 Evolution of CAR T cells（CAR T細胞的演變）
1.3.1 First generation（第一代）
第一代CAR的設計靈感來源于將抗體的抗原識別功能與TCR的信號傳導功能相結合。其細胞內信號傳導區(qū)僅包含CD3ζ鏈，這種設計的CAR T細胞在臨床試驗中顯示出一定的抗腫瘤活性，但由于其增殖能力、細胞毒性功能和持久性有限，治療效果并不理想。

1.3.2 Second generation（第二代）
為了增強CAR T細胞的功能，第二代CAR在第一代的基礎上增加了共刺激信號域（如CD28或4-1BB）。這種設計顯著提高了CAR T細胞的增殖能力、細胞因子分泌和持久性。與CD28信號域相比，4-1BB信號域的CAR T細胞在體內具有更長的持久性和更低的激活誘導細胞死亡（AICD）風險，但CD28信號域的CAR T細胞在早期細胞毒性功能上更強。目前，所有已獲FDA批準的CAR T細胞產(chǎn)品均采用第二代CAR設計。

1.3.3 Third generation（第三代）
第三代CAR進一步在細胞內信號傳導區(qū)增加了第二個共刺激信號域（如CD28和4-1BB或OX40等）。這種設計旨在進一步增強CAR T細胞的激活、增殖和持久性。然而，臨床試驗結果表明，第三代CAR T細胞與第二代相比在療效和安全性上并無顯著差異，因此其優(yōu)勢仍有待進一步研究。

1.3.4 Fourth generation（第四代）
第四代CAR T細胞被稱為“TRUCKs”（T細胞重定向用于抗原非限制性細胞因子介導殺傷的T細胞），其特點是CAR T細胞被設計為能夠分泌細胞因子（如IL-12、IL-18、IL-15、IL-7、IL-21等）。這種設計的目的是增強CAR T細胞的抗腫瘤功能，并通過細胞因子招募旁觀者T細胞參與抗腫瘤反應，從而克服實體瘤中CAR T細胞療效不佳的問題。此外，針對腫瘤微環(huán)境的策略也被納入第四代CAR的設計中，例如通過表達逆轉信號受體（如IL-4R/IL-7R）或分泌抗體來中和免疫抑制因子（如TGF-β）。

IL-12 TRUCKs

• 性能變化：IL-12是一種強效的促炎細胞因子，能夠顯著增強CAR T細胞的抗腫瘤活性。它通過激活T細胞和NK細胞，增強IFN-γ的分泌，從而提高細胞毒性功能（Ferlazzo et al., 2004; Kubin et al., 1994）。此外，IL-12可以阻斷Tregs的擴增，減少免疫抑制（X. Cao et al., 2009）。
• 表型變化：IL-12分泌的CAR T細胞傾向于分化為Th1表型，表現(xiàn)出更強的細胞毒性和抗腫瘤能力（Manetti et al., 1993）。然而，IL-12的全身應用可能導致嚴重的毒性，如肝毒性、肺毒性等（Car et al., 1999）。因此，通過CAR T細胞在腫瘤局部分泌IL-12，可以在減少系統(tǒng)性毒性的同時增強抗腫瘤效果（Chmielewski & Abken, 2015）。

IL-18 TRUCKs

• 性能變化：IL-18是一種多效性細胞因子，能夠增強T細胞和NK細胞的增殖和IFN-γ分泌（Yasuda et al., 2019）。在小鼠模型中，IL-18分泌的CAR T細胞顯示出更強的抗腫瘤活性，尤其是對大型實體瘤（Chmielewski & Abken, 2017）。
• 表型變化：IL-18能夠推動T細胞向T-bet高表達、FoxO1低表達的效應細胞表型分化，同時減少M2型巨噬細胞和Tregs的數(shù)量，增加M1型巨噬細胞和NK細胞的比例（Chmielewski & Abken, 2017）。這種表型變化有助于增強CAR T細胞在實體瘤中的浸潤和抗腫瘤效果。

IL-15 TRUCKs

• 性能變化：IL-15能夠增強T細胞的增殖和細胞毒性功能，同時通過提高granzyme B的表達來維持T細胞的活性（Tamang et al., 2006）。在小鼠模型中，IL-15分泌的CAR T細胞顯示出更強的抗腫瘤活性和更長的持久性（Hoyos et al., 2010）。
• 表型變化：IL-15分泌的CAR T細胞傾向于維持早期記憶細胞（TSCM）和中央記憶細胞（TCM）的表型，這些細胞具有更強的增殖能力和更長的存活時間（Hoyos et al., 2010）。此外，IL-15還能夠減少PD-1等抑制性受體的表達，從而增強CAR T細胞的抗腫瘤功能。

IL-7 TRUCKs

• 性能變化：IL-7是一種重要的細胞因子，能夠促進T細胞的增殖和存活，同時具有抗凋亡作用（MacKall et al., 2011）。IL-7分泌的CAR T細胞在體內外均顯示出更強的抗腫瘤活性和更長的持久性（L. Li et al., 2012）。
• 表型變化：IL-7能夠維持T細胞的早期分化狀態(tài)，減少終末分化效應細胞的比例（Schluns et al., 2000）。這種表型變化有助于CAR T細胞在體內長期存活并持續(xù)發(fā)揮抗腫瘤作用。

IL-21 TRUCKs

• 性能變化：IL-21是一種多效性細胞因子，能夠增強T細胞的增殖、存活和細胞毒性功能，同時維持早期記憶細胞的表型（Hinrichs et al., 2008）。在小鼠模型中，IL-21分泌的CAR T細胞顯示出更強的抗腫瘤活性和更長的持久性（Štach et al., 2020）。
• 表型變化：IL-21能夠維持T細胞的早期記憶細胞（TSCM）和中央記憶細胞（TCM）的表型，減少終末分化效應細胞的比例（Hinrichs et al., 2008）。此外，IL-21還能夠抑制Tregs的擴增，減少免疫抑制（Attridge et al., 2012）。這種表型變化有助于CAR T細胞在體內長期存活并持續(xù)發(fā)揮抗腫瘤作用。

IL-10 TRUCKs

• 性能變化：IL-10是一種具有抗腫瘤活性的細胞因子，能夠增強T細胞的代謝適應性和抗腫瘤功能（Fujii et al., 2001）。在小鼠模型中，IL-10分泌的CAR T細胞顯示出更強的抗腫瘤活性和更長的持久性（Y. Zhao et al., 2024）。
• 表型變化：IL-10能夠促進T細胞向早期記憶細胞（TSCM）表型分化，增強其代謝適應性和抗腫瘤功能（Y. Zhao et al., 2024）。此外，IL-10還能夠減少免疫抑制細胞（如Tregs和MDSCs）的數(shù)量，從而增強CAR T細胞的抗腫瘤效果。

1.3.5 Fifth-generation, next-generation（第五代及下一代）
第五代CAR T細胞的設計更加復雜，引入了邏輯門控（如“OR”、“AND”、“NOT”等）的概念，以實現(xiàn)更精準的靶向和更高的安全性。這些設計利用合成生物學和邏輯門控技術，使CAR T細胞能夠根據(jù)特定的邏輯條件進行激活或抑制。以下是邏輯門控的具體設計和實現(xiàn)：

1.3.5.1 “OR-gate”（或門）
“OR-gate”設計允許CAR T細胞在識別多個抗原中的任意一個時被激活。這種設計可以防止腫瘤細胞通過丟失或下調單一抗原來逃逸治療。具體實現(xiàn)方式包括：

• 雙靶向：通過共表達兩個CAR分子，每個CAR識別不同的抗原。例如，Ruella等（2016）通過共表達針對CD19和CD20的CAR，顯著提高了CAR T細胞的抗腫瘤效果。
• 串聯(lián)CAR（TanCAR）：將兩個scFv串聯(lián)在一起，形成一個雙特異性CAR。這種設計允許CAR T細胞在識別任意一個抗原時被激活，并且在識別兩個抗原時表現(xiàn)出更強的信號傳導（Grada等，2013）。
• 環(huán)狀串聯(lián)CAR：將scFv以環(huán)狀結構排列，進一步優(yōu)化了雙特異性CAR的設計（Z. Chen等，2023）。

1.3.5.2 “AND-gate”（與門）
“AND-gate”設計要求CAR T細胞只有在同時識別多個特定抗原時才會被激活。這種設計可以減少非靶向組織的毒性，提高治療的安全性。具體實現(xiàn)方式包括：

• 組合信號：通過設計兩個CAR分子，每個CAR提供一個信號，只有當兩個信號同時存在時，CAR T細胞才會被完全激活（Kloss等，2013）。
• 合成Notch受體（synNotch）：通過synNotch系統(tǒng)，CAR T細胞在識別第一個抗原后，會誘導第二個CAR的表達，從而實現(xiàn)“AND-gate”邏輯（Roybal等，2016）。例如，Choe等（2021）利用synNotch系統(tǒng)在治療膠質母細胞瘤的CAR T細胞中實現(xiàn)了精確的靶向。
• 3-input AND-gate：Williams等（2020）開發(fā)了一種3-input AND-gate系統(tǒng)，通過級聯(lián)或并行設計，實現(xiàn)了更復雜的邏輯控制。在小鼠模型中，這種系統(tǒng)能夠精確識別三陽性腫瘤細胞，并表現(xiàn)出優(yōu)異的抗腫瘤效果。

1.3.5.3 “NOT-gate”（非門）
“NOT-gate”設計允許CAR T細胞在識別非腫瘤抗原時被抑制，從而避免對正常組織的攻擊。具體實現(xiàn)方式包括：

• 抑制性CAR（iCAR）：通過將抑制性受體（如PD-1或CTLA-4）的細胞內信號傳導區(qū)替換為CAR T細胞的信號傳導區(qū)，實現(xiàn)對非腫瘤抗原的抑制（Fedorov等，2013）。例如，Aoyama等（2022）開發(fā)了一種“Scissor CAR”，通過識別健康細胞表面的抗原，抑制CAR T細胞的激活。
• OFF-Notch受體：通過設計OFF-Notch受體，當識別到健康組織抗原時，會誘導表達凋亡因子，從而導致CAR T細胞的凋亡（Williams等，2020）。

1.3.5.4 Universal CARs（通用CAR）
通用CAR設計允許CAR T細胞通過適配器分子識別多種抗原，從而實現(xiàn)CAR T細胞的多功能性和通用性。這種設計可以降低治療成本并提高治療的靈活性。具體實現(xiàn)方式包括：

• Fc結合適配器CAR：通過設計CAR T細胞表達Fc受體，使其能夠結合抗體藥物，從而實現(xiàn)對多種抗原的識別（Kudo等，2014）。
• 標簽特異性適配器CAR：通過設計CAR T細胞識別特定的標簽分子（如生物素或FITC），并結合相應的適配器分子，實現(xiàn)對多種抗原的識別（Lohmueller等，2018）。
• 雙特異性分子結合適配器CAR：通過設計CAR T細胞結合雙特異性抗體，實現(xiàn)對多種抗原的識別（Choi等，2019）。

1.3.5.5 CAR with JAK/STAT signaling（JAK/STAT信號通路CAR）
通過將細胞因子受體的信號傳導域整合到CAR中，CAR T細胞可以在沒有外源細胞因子的情況下持續(xù)激活。這種設計可以增強CAR T細胞的增殖和持久性（Kagoya等，2018）。

1.3.5.6 Suicide switches（自殺開關）
為了提高CAR T細胞治療的安全性，研究者們開發(fā)了自殺開關技術，通過引入可誘導的凋亡基因或代謝開關，可以在CAR T細胞引起嚴重不良反應時將其清除。具體實現(xiàn)方式包括：

• 代謝開關：通過設計CAR T細胞表達代謝酶，使其在特定代謝物存在時發(fā)生凋亡（Berger等，2006）。
• 誘導性凋亡基因：通過設計CAR T細胞表達誘導性凋亡基因（如iCasp9），在特定藥物存在時誘導CAR T細胞凋亡（Stasi等，2011）。
• 表面抗原靶向：通過設計CAR T細胞表達特定的表面抗原，使其能夠被抗體藥物靶向清除（Griffioen等，2009）。

CAR T細胞療法作為一種革命性的癌癥治療方法，已經(jīng)取得了顯著的臨床療效，尤其是在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中。然而，CAR T細胞在實體瘤治療中的應用仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如腫瘤微環(huán)境的免疫抑制、CAR T細胞的持久性和安全性等。隨著合成生物學和邏輯門控技術的發(fā)展，第五代及下一代CAR T細胞設計引入了邏輯門控的概念，通過“OR-gate”、“AND-gate”和“NOT-gate”等邏輯門控，實現(xiàn)了更精準的靶向和更高的安全性。這些設計不僅提高了CAR T細胞的抗腫瘤效果，還減少了對正常組織的毒性。未來，隨著技術的不斷進步，CAR T細胞療法有望在更多類型的癌癥治療中發(fā)揮重要作用。