第一期的Q&A相信大家對重組蛋白這個小可愛已經(jīng)有了初步了解，接下來就讓我們就其表達體系，使用中的常見問題繼續(xù)一探究竟吧！！

一、表達體系與選擇

（一）重組蛋白表達體系

大腸桿菌表達系統(tǒng)：優(yōu)點是經(jīng)濟實惠、表達背景清晰、表達快速便捷、產(chǎn)量高、應用范圍廣泛。然而，缺點也較為明顯，容易形成包涵體，且翻譯后無法修飾表達，對于大分子蛋白來說，表達相對困難。例如，一些復雜的蛋白質在大腸桿菌中可能無法正確折疊，導致活性降低。

酵母細胞表達系統(tǒng)：具有經(jīng)濟實惠、成本投入低、蛋白表達迅速且產(chǎn)量高的優(yōu)點，部分蛋白還可以實現(xiàn)翻譯后修飾。但缺點是蛋白包含非人源糖基化以及高甘露糖修飾，可能會影響蛋白的功能和活性。

昆蟲細胞表達系統(tǒng)：蛋白表達基因容量大，可溶蛋白相對更高，對于用于制備毒性蛋白，可實現(xiàn)翻譯后修飾。不過，蛋白表達周期長，需要投入的成本高，而且表達的蛋白缺少部分糖基化。例如，在制備某些復雜的毒性蛋白時，昆蟲細胞表達系統(tǒng)雖然能夠實現(xiàn)表達，但整個過程可能需要數(shù)周甚至數(shù)月的時間。

哺乳動物細胞表達系統(tǒng)：蛋白可溶性高，且生產(chǎn)的蛋白內毒素較低，蛋白活性更高而且可實現(xiàn)翻譯后修飾。但缺點是蛋白表達周期長而且投入的成本相對較高。一般來說，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的成本可能是其他表達系統(tǒng)的數(shù)倍甚至更高。

（二）選擇重組蛋白技巧

表達體系：根據(jù)實驗目的和蛋白特性選擇合適的表達體系。如果需要快速獲得大量蛋白且對翻譯后修飾要求不高，可以選擇大腸桿菌表達系統(tǒng)；如果需要一定程度的翻譯后修飾且對糖基化要求不那么嚴格，可以考慮酵母細胞表達系統(tǒng)；對于復雜的蛋白尤其是需要毒性蛋白表達或具有特定翻譯后修飾要求的，可以選擇昆蟲細胞或哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。

標簽及位置：蛋白標簽有助于目的蛋白的表達、純化、檢測和示蹤等。常用的標簽有 His/6xHis、Flag、GST、C-Myc、HA、GFP、mCherry、C-Fc 等。標簽位置會對重組蛋白的結構與特性造成影響，對于較難表達或較容易降解的蛋白，可將融合標簽選擇在N端以提高穩(wěn)定性和減小免疫原性；若為分泌蛋白，建議構建在C端，因為在分泌到高爾基體的過程中，N 端的融合標簽會隨著 N 端信號肽的切除而失去作用。

有無載體蛋白：載體蛋白可提高重組蛋白的穩(wěn)定性，避免重組蛋白粘附在管壁導致活性下降。常用的載體蛋白有 0.1% BSA、5%人血清白蛋白 HSA、10% FBS、海藻糖等，最常用的是 0.1% BSA。

是否無動物成分：無動物成分重組蛋白在生產(chǎn)過程中不使用任何動物來源的原料和試劑，避免了痕量的動物成分、動物病原體和抗原對實驗造成影響。主要應用于可能進入臨床試驗的重組蛋白藥物研究和需要明確培養(yǎng)條件的實驗。

內毒素水平：內毒素主要是G -菌細胞壁外表層結構成分，本質是脂多糖LPS。內毒素污染十分危險，可引發(fā)動物內毒素休克、炎癥或敗血癥，并對組織培養(yǎng)物有害。大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)的蛋白具有更高水平的內毒素，在選擇重組蛋白產(chǎn)品時，尤其是應用于細胞培養(yǎng)、動物體內實驗等領域時，內毒素水平是重要參考要素。

活性：重組蛋白活性分為ED50和比活力兩個數(shù)據(jù)。ED50是能引起50%陽性反應或50% 最大效應的濃度或劑量，一般來說 ED50 值越小，作用越強。比活力是在特定條件下，單位重量蛋白質所具有的酶活力單位數(shù)，比活力越大，酶的純度越高。

純度：重組蛋白的純度可通過SDS-PAGE或HPLC鑒定。高純度的重組蛋白可以減少雜質對實驗結果的干擾。

片段形式：由于技術限制、表達效率等問題，重組蛋白使用片段形式可能更易于純化和表達，提高溶解性和穩(wěn)定性。

二、溶解注意事項

（一）開蓋前離心處理

細胞因子重組蛋白通常以凍干粉的形式保存，在運輸過程中可能會因顛簸而漂散并粘貼于管壁或管蓋上。因此，在開蓋前進行離心處理至關重要。通過離心處理，可以確保蛋白粉末集中在管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉完全溶解，從而避免因蛋白分散而影響溶解效果。

（二）正確選擇溶解液

不同的重組蛋白需要用特定的溶液溶解，這是由蛋白質的性質決定的。我們知道，蛋白的溶解性與很多因素有關，其中比較重要的是pH值和離子強度。例如，重組人IL-5需用水溶解，而重組人IL-2則需用 100mM Acetic Acid（醋酸）溶解，重組人TGF-beta1 需用 10mM Citric Acid（檸檬酸），pH3.0 溶解。對于重組細胞因子凍干粉來說，即使是同一個分子的蛋白，不同批次間的溶解方法也可能會有所不同，因此具體應該如何溶解應以相應批次的說明書為準。

（三）溶解濃度要求

重組蛋白應溶解到指定濃度范圍，這對于保持蛋白的穩(wěn)定性至關重要。蛋白在一定的濃度范圍內可以保持良好的穩(wěn)定性，這個范圍就是說明書上所標明的濃度范圍。如重組人 FGF-6為0.5 - 1.0mg/ml，而重組人Activin B則一定要是0.5mg/ml。如果高于或低于這個濃度范圍，就可能會使細胞因子的活性下降。如果高于這個濃度范圍，就有可能會超過該因子的最大溶解度，使其無法完全溶解。還有就是高于或低于這個范圍，可能會出現(xiàn)蛋白質聚集現(xiàn)象，同樣會使部分蛋白質不溶解，導致蛋白質活性下降。

（四）避免振蕩溶解

不能用渦旋儀振蕩溶解重組蛋白，因為對于細胞因子重組蛋白來說，只有具有一定的空間結構才可能使其活性。在凍干粉溶解過程中，用渦旋振蕩器進行 vortex 會破壞蛋白的空間結構，從而影響蛋白的活性。

上海逐典在擁有GMP級質量管理體系平臺的基礎上，結合細胞治療藥物生產(chǎn)規(guī)范，提供細胞治療關鍵環(huán)節(jié)生產(chǎn)物料，提供全品類多種細胞因子，助力不同領域生物藥物的研究，加速臨床、上市申報進程。

逐典相關產(chǎn)品

細胞因子

產(chǎn)品特性

• 高生物活性
• 偏向性

訂購信息