2. 基質(zhì)細胞、髓系細胞和T細胞亞型的缺氧評分
為了評估TME中這些主要細胞類型的缺氧水平，我們對來自癌癥組織的細胞進行了亞聚類分析，并計算了癌癥類型中每個亞型的缺氧評分�；|(zhì)細胞的亞簇主要分為三大類：周細胞、肌成纖維細胞和成纖維細胞（補充圖2A）。由于SCC中幾乎沒有成纖維細胞（710個細胞），我們未能對該癌癥中的基質(zhì)細胞進行亞分類，而對基質(zhì)細胞的其余研究集中于其他五種癌癥類型。我們以標記的形式按順序命名成纖維細胞簇（例如，F(xiàn)S1和FS2分別是簇0和1）。根據(jù)先前研究的標志物（Costa et al.，2018；Kieffer et al.，2020）和每個簇中顯著上調(diào)的基因，我們將成纖維細胞稱為特定癌癥類型中的膠原蛋白相關CAF、趨化因子相關CAF和白細胞介素（IL）信號相關CAF。白細胞介素信號相關CAF[BC中的FS5（簇4）]上調(diào)了炎癥特征，如BC中的干擾素反應和炎癥反應（圖2A）。六種癌癥類型的膠原相關CAF[FS1（簇0）]表現(xiàn)出最高的細胞外基質(zhì)（ECM）重塑得分（補充圖2B）。然而，癌癥類型的CAF缺氧評分沒有一致的趨勢。

從兩個方面對髓樣細胞進行了研究，包括亞型鑒定和炎癥特征評估。使用常規(guī)標記基因，我們鑒定了樹突狀細胞、單核細胞和巨噬細胞，并發(fā)現(xiàn)了所有癌癥類型的共同亞群（補充圖2C）。我們根據(jù)先前研究中引用的標記物/基因集區(qū)分了促炎和抗炎單核細胞/巨噬細胞（Azizi等人，2018；圖2B和補充圖3A）。然而，一些特定的TAM具有混合表型，表達促炎和抗炎特征以及M1和M2基因特征（圖2B和補充圖2C、3A），與之前的研究一致（Lee等人，2020）。值得注意的現(xiàn)象是，SPP1在一個亞型中表達較高，如BC中的M-S1（簇0）；CRC中的M-S3（簇2）；LC中的M-S1（簇0）和M-S2（簇1）；OV中的M-S1（簇0）和M-S5（簇4）；PDAC中的M-S2（簇1）；以及SCC中的M-S3（簇2），其在六種癌癥類型中普遍存在（圖2B和補充表2）。我們將這些亞型命名為SPP1+TAM，發(fā)現(xiàn)與ECM重塑相關的基質(zhì)金屬肽酶9（MMP9）也在SPP1+TAMs中高度表達（圖2B）。值得注意的是，與其他亞型相比，SPP1+TAM的缺氧評分更高（圖2B）。鑒于SPP1+TAM的上述特征，它們可能在缺氧TME的影響下在腫瘤進展中發(fā)揮核心作用。

T/NK細胞的亞群導致CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞的鑒定（補充圖3C）。我們打算通過關鍵抑制性受體（PDCD1、TIGIT、HAVCR2、LAG3和CTLA4）的基因表達來鑒定CD8+T細胞的耗竭狀態(tài)（補充圖3C）。然而，表達耗竭基因的細胞在CD8+T細胞中也高度表達細胞毒性標志物（GZMB和IFNG），這進一步證實了一個特定的亞群高度表現(xiàn)出細胞毒性評分和耗竭評分（補充圖3D）。如補充圖3D所示，與其他簇相比，CRC中的CD8-S3（簇4）表現(xiàn)出更高的細胞毒性和耗竭評分。這一觀察結果似乎是一個與之前的scRNA-seq研究類似的激活依賴性耗竭表達程序（Guo等人，2018）。出乎意料的是，耗盡的CD4+T細胞[CD4-S5（簇4）在BC；CD4-S9（簇8）在CRC；CD4-S6（簇5）在LC；CD4-S4（簇3）在PDAC；和CD4-S4在SCC]在五種癌癥類型中被區(qū)分。由于之前的一項研究（Scharping等人，2021）表明T細胞耗竭是在缺氧環(huán)境下驅(qū)動的，因此有人認為缺氧和耗竭之間可能存在關聯(lián)。然后，我們進行了相關性分析，發(fā)現(xiàn)缺氧評分與六種癌癥類型T細胞的衰竭評分高度相關，但與細胞毒性評分無關（圖2D）。
 

3. 惡性細胞的轉錄異質(zhì)性及其與缺氧的關系
我們獲得了惡性上皮細胞亞群和每個亞群的DEGs。接下來，我們探討了同一癌癥類型中不同癌癥細胞的表達狀態(tài)如何變化，并應用了反映癌癥相關標志性途徑活性的GSVA。一些亞群的GSVA分布顯示，與上皮間質(zhì)轉化（EMT）和血管生成相關的基因顯著富集，而一些亞群在細胞周期相關的標志物中高度富集：E2F/MYC靶點和G2M檢查點，表明腫瘤內(nèi)異質(zhì)性（圖3）。值得注意的是，觀察到高缺氧亞群與EMT程序亞群相同。妊娠早期STB中的亞型特異性增強子-基因調(diào)控網(wǎng)絡
 

4. 骨髓基質(zhì)細胞與癌癥細胞的串擾
為了破譯細胞間相互作用的分子關聯(lián)，我們使用潛在的配體-受體（L-R）對相互作用構建了不同細胞亞型之間的細胞通訊網(wǎng)絡（補充圖4A和補充表5）。重要的是，癌癥細胞和髓細胞之間的相互作用數(shù)量被預測為六種癌癥類型細胞網(wǎng)絡中最普遍的（補充圖4A）。此外，我們接下來分析了患者中這些亞簇之間的各自比例之間是否存在任何相關性，并發(fā)現(xiàn)了一些共現(xiàn)的細胞亞簇（補充圖4B和補充表6），例如一些成纖維細胞和癌癥細胞亞簇之間在BC和OV中相關的比例。

鑒于癌癥細胞與髓細胞以及基質(zhì)細胞之間的串擾被預測為普遍存在，我們重點分析了這些細胞類型之間的相互作用，并詢問了它們?nèi)绾我蕴囟ǚ绞较嗷ビ绊懸源龠M癌癥進展（圖4A和補充圖5）。在BC和OV中，基質(zhì)細胞是與癌癥細胞相互作用的廣泛細胞類型（圖4A和補充圖5）。胰島素樣生長因子1（IGF1）可由基質(zhì)細胞分泌，通過結合其在癌癥細胞上的受體來調(diào)節(jié)癌癥細胞的生長。癌癥細胞表達的胰島素樣生長因子1受體（IGF1R）基因與BC中的雌激素反應信號高度相關，這可能表明IGF1對IGF1R的結合作用以及激活雌激素信號增強了癌癥的生長（圖4B）。S型蛋白酪氨酸磷酸酶受體（PTPRS）在OV癌癥細胞中高度表達，并與MYC/E2F靶點相關，表明多效性蛋白（PTN）由與其受體結合的成纖維細胞分泌，以促進癌癥細胞生長（圖4B）。相應地，IGF1R和PTPRS的表達分別與BC和OV中的雌激素反應相關基因ESR1和MYC靶基因SLC2A1呈正相關（圖4B）。此外，癌癥細胞亞簇[CS1（簇0）]和間質(zhì)細胞亞簇（FS3和FS4）的比例在BC中也顯示出正相關（圖4C）。這些結果表明，成纖維細胞可能通過表達和分泌不同的生長因子來促進腫瘤細胞增殖。
 

5. 腫瘤相關巨噬細胞可能促進癌癥細胞的上皮-間充質(zhì)轉移
為了研究巨噬細胞通過常見的L–R對（TNFSF12–TNFRSF12A和SPP1–CD44）對腫瘤細胞的特異性影響，我們進一步計算了癌癥細胞中TNFRSF12 A或CD44表達與標志性特征評分之間的相關性。結果顯示，血管生成、糖酵解和EMT是與CD44表達最相關的生物學過程，而在癌癥細胞中，通過NFκB、血管生成、IL6_JAK_STAT3途徑和EMT的TNFα信號傳導與CRC、LC和SCC中的TNFRSF12A相關（圖5A和補充表7）。由于SPP1主要在巨噬細胞中表達（補充圖6A），我們進一步檢測到SPP1+TAMs的相對豐度[LC中的M-S2（簇1）和CRC中的M-S3（簇2）]以及EMT高的癌癥細胞亞簇[CC中的CS1（簇0）和CRC中的CS2（聚類1）]在LC和CRC中相互關聯(lián)，這進一步加強了SPP1+TAM促進EMT的功能（補充表2和圖5B）。
 

6. SPP1在缺氧腫瘤微環(huán)境中上調(diào)與預后不良有關
由于發(fā)現(xiàn)SPP1+TAM具有較高的缺氧評分（圖2B）和與EMT癌癥細胞共現(xiàn)（圖5B），我們專注于探索SPP1和SPP1+TAMs的功能。與正常組織相比，腫瘤樣本來源的巨噬細胞中SPP1的表達上調(diào)（圖6A）；我們推斷SPP1是TAMs中TME誘導的特異性表達程序。TCGA癌癥樣本進一步證實了這些發(fā)現(xiàn)，表明與鄰近的正常組織相比，在相應的癌癥類型中觀察到腫瘤組織中SPP1的表達高得多（補充圖7A）。同時，發(fā)現(xiàn)PDAC和LC含有更高比例（>50%）的SPP1+TAM（補充圖7B）。利用從TCGA項目收集的臨床數(shù)據(jù)，我們證實，SPP1基因表達水平較高的患者在六種癌癥類型中表現(xiàn)出較差的預后，包括本研究中研究的癌癥（圖6B），SPP1+TAM比例較高也與較差的臨床結果相關（補充圖7C），表明SPP1和SPP1+TAMs對癌癥的臨床影響。