圖 1. 實(shí)驗(yàn)流程和操作步驟。 
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1. 選擇細(xì)胞：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇生長速度、形態(tài)、特性等合適的細(xì)胞系或提取原代細(xì)胞。

2. 觀察細(xì)胞狀態(tài)：將細(xì)胞放置在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)及密度。以貼壁細(xì)胞為例，若培養(yǎng)基澄清透明且無漂浮雜質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞生長至 80-90% 密度且狀態(tài)良好時(shí)，則可以進(jìn)行細(xì)胞傳代或鋪板。

3. 細(xì)胞消化：將細(xì)胞進(jìn)行傳代，棄去培養(yǎng)基，取適量的 PBS 輕輕潤洗 2-3 次，吸盡上清。加入適量的胰酶置于 37℃ 培養(yǎng)箱中消化 (消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞類型而定)，待細(xì)胞皺縮且間隙變大、可從皿底滑落且不聚團(tuán)成塊時(shí)即可加培養(yǎng)基終止消化。
小貼士：應(yīng)隨時(shí)觀察細(xì)胞消化狀態(tài)，消化時(shí)間太短或太長都會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài)哦~

三、細(xì)胞計(jì)數(shù)

將終止消化的細(xì)胞輕輕吹打，使細(xì)胞完全從皿底脫落。將細(xì)胞懸液收集至離心管中，以 800-1000 rpm，3 min 進(jìn)行離心，棄上清。加入適量的完全培養(yǎng)基充分重懸細(xì)胞團(tuán)塊，輕輕吹打混勻后取 10 μL 細(xì)胞懸液與 10 μL 臺盼藍(lán)輕輕混勻，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)鋪板密度的需要計(jì)算所需細(xì)胞懸液的體積。

四、細(xì)胞鋪板

▐ 確定鋪板密度
1. 不同孔板鋪細(xì)胞數(shù) (以 HEK 293 細(xì)胞為例) 鋪板密度

  
小貼士： 細(xì)胞密度太大容易造成細(xì)胞活性差和細(xì)胞死亡，細(xì)胞密度太小會(huì)造成細(xì)胞生長緩慢，產(chǎn)物表達(dá)降低和污染風(fēng)險(xiǎn)增加。

圖 3. HT-1080 細(xì)胞鋪板 1 h 內(nèi)拍照。 
密度太大（左）和密度太�。ㄓ遥�

表 2. 不同直徑的細(xì)胞鋪板密度需求^[1]。

  小貼士：

• 接種密度：小細(xì)胞可以在相對較高的密度下生長，而大細(xì)胞需要較低的密度以避免接觸抑制。

• 細(xì)胞形態(tài)：大細(xì)胞通常需要更多空間來擴(kuò)展和生長。

• 時(shí)間和方法：大細(xì)胞細(xì)胞生長較慢，需要更長的時(shí)間來生長到可傳代的狀態(tài)。在處理和傳代時(shí)，大細(xì)胞需要更溫和以減少對細(xì)胞的損傷。

表 3. 不同實(shí)驗(yàn)類型的細(xì)胞鋪板密度需求。 

▐ 鋪板操作

確定鋪板密度后，根據(jù)自己所需的細(xì)胞量即可計(jì)算所需的細(xì)胞懸液體積。

舉個(gè)栗子：若需要 5 mL 密度為 10⁵/mL 的細(xì)胞量，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果為 2×10⁶/mL，則吸取 250 μL 的細(xì)胞懸液與 4.75 mL 的完全培養(yǎng)基混合即可。

用移液槍吸取適量的細(xì)胞懸液 (避免吸取氣泡)，在培養(yǎng)皿上方豎直懸空均勻、緩慢地滴加在各個(gè)角落。蓋上培養(yǎng)皿后沿著水平桌面采用“8”字法或者“十字”形輕輕搖晃培養(yǎng)皿，重復(fù) 5-6 次確保使細(xì)胞均勻分布在培養(yǎng)皿中，然后進(jìn)行鋪板操作^[10]。

2. 其他孔板或者培養(yǎng)皿：

• 8 字法：以 24 孔板為例，細(xì)胞鋪完后，貼著水平桌面畫 “8” 字軌跡，重復(fù) 5-6 次。
• 十字混勻法：以 24 孔板為例，細(xì)胞鋪完后，貼著水平桌面先上下移動(dòng)，再左右移動(dòng)，呈十字形狀，重復(fù) 5-6 次。

• 搖晃過程中應(yīng)注意力度，防止培養(yǎng)基濺灑出來污染細(xì)胞哦~
• 細(xì)胞易沉降，建議每鋪一部分孔 (比如半塊板)，及時(shí)混勻預(yù)先配制的細(xì)胞懸液，然后繼續(xù)鋪板。

鋪完細(xì)胞后記得顯微鏡下觀察確認(rèn)細(xì)胞的均勻度和密度，如果你能觀察到細(xì)胞“顆粒”分明、分布均勻且密度中等，那么恭喜你，細(xì)胞鋪板工作你已經(jīng)完美結(jié)束啦~趕緊將你的細(xì)胞放回恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)啦！

圖 5. 成功鋪板后的 HT-1080 細(xì)胞 0 h（左）和 2 h（右）。 

最后！��！千萬不要鋪完細(xì)胞就撒手不管啦~細(xì)胞也是有生命的，需要被時(shí)時(shí)“關(guān)愛”與“呵護(hù)”的哦~

• 定期使用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、增殖情況。
• 記錄細(xì)胞生長曲線，評估實(shí)驗(yàn)效果。
• 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康�，適時(shí)進(jìn)行細(xì)胞處理 (如藥物添加、轉(zhuǎn)染等)，并繼續(xù)觀察細(xì)胞。

三、細(xì)胞形態(tài)異常或死亡、凋亡

可能性原因：

1. 細(xì)胞密度過大或過小，過度擁擠或稀疏；
2. 培養(yǎng)條件不當(dāng)對細(xì)胞造成損傷，比如溫度、氣體成分和培養(yǎng)基；
3. 培養(yǎng)基組分出現(xiàn)過期或變質(zhì)；
4. 在重懸和鋪板過程中，強(qiáng)烈搖晃或過度機(jī)械性操作。

03
小結(jié)

除了以上的秘密小技巧外，細(xì)胞鋪板也離不開操作手法上的經(jīng)驗(yàn)積累。希望能夠幫助到每一位科研工作者順利、圓滿的得到自己想要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果哦！