美白功效體外評(píng)估的可視化技術(shù)3D黑色素表皮模型的介紹
東方女性以白為美，膚色白皙常常與青春貌美聯(lián)系在一起，我國更是有“一白遮三丑”的俗語，因此美白功效產(chǎn)品一直是化妝品研發(fā)的熱點(diǎn)。隨著合成生物學(xué)蓬勃發(fā)展以及《化妝品注冊(cè)備案管理辦法》中對(duì)新原料的規(guī)定，對(duì)美白新原料的研發(fā)和功效驗(yàn)證變得更加炙手可熱。在美白化妝品原料或產(chǎn)品研發(fā)階段，通常會(huì)采用體外試驗(yàn)方法評(píng)估其美白功效，主要包括基于酪氨酸酶活性生化方法、2D單層黑色素細(xì)胞生物學(xué)方法，體外重建3D皮膚模型替代方法等，不同評(píng)估方法在原料/配方產(chǎn)品美白功效篩選的不同階段發(fā)揮著不同作用，總體上，美白原料、配方產(chǎn)品功效篩選邏輯就像金字塔一樣如圖1，比如基于重建3D黑色素表皮模型篩選適用于已初步確認(rèn)有一定美白作用的原料/配方產(chǎn)品篩選。
重建3D黑色素表皮模型以人源正常組織角質(zhì)形成細(xì)胞和黑色素細(xì)胞為種子以一定的比例接種于特定生長環(huán)境中，經(jīng)過浸沒培養(yǎng)和氣液培養(yǎng)增殖分化出類似于正常人表皮復(fù)層組織結(jié)構(gòu)，模擬人使用化妝品場(chǎng)景多次涂抹于模型表面，可以從黑色素細(xì)胞功能、黑色素的合成以及向角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝等多個(gè)功效機(jī)制出發(fā)，通過實(shí)驗(yàn)技術(shù)獲取基因水平、蛋白水平與組織水平等多維度功效數(shù)據(jù)，可以對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行綜合全面的美白功效評(píng)估，比生物化學(xué)法和細(xì)胞生物學(xué)法更系統(tǒng)、更真實(shí)反應(yīng)產(chǎn)品美白功效。
格寧生物（ScreeNingBio，SNB）實(shí)驗(yàn)室于2022年建立了基于體外重建3D黑色素表皮模型Skinovo® -Mela美白功效評(píng)估檢測(cè)平臺(tái)，采用模擬人涂抹化妝品使用場(chǎng)景將一定量待測(cè)物多次均勻涂抹于3D模型表面，主要檢測(cè)指標(biāo)包括黑色素相關(guān)基因表達(dá)、表觀亮度（L值）、模型中黑色素含量，可視化指標(biāo)包括表觀色度、黑色素分布、模型中黑色素細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)和酪氨酸酶活性等如表1。
針對(duì)每一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行詳細(xì)介紹：
國際照明委員會(huì)CIE建立的L*a*b*色度系統(tǒng)，在人體膚色分類、美白化妝品功效評(píng)價(jià)中得到了普遍認(rèn)可和應(yīng)用。其中L*表征表觀亮度，其值越大，顏色越偏向白色，小則越偏向黑色。在美白功效評(píng)估數(shù)據(jù)中，表觀亮度L數(shù)據(jù)可以原始數(shù)據(jù)呈現(xiàn)也可以以ΔL數(shù)據(jù)呈現(xiàn)如圖2。
經(jīng)過待測(cè)物處理后黑色素表皮模型中黑色素含量的變化是衡量待測(cè)物美白功效的黃金標(biāo)準(zhǔn)。黑色素是化學(xué)結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜的一類大分子聚合物，一般采用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿溶解進(jìn)行絕對(duì)定量或相對(duì)定量圖3,4，可以根據(jù)客戶需求選擇方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
格寧生物實(shí)驗(yàn)室重點(diǎn)開發(fā)了基于3D皮膚模型研究美白功效的可視化技術(shù)，表觀色度變化是其中一個(gè)可視化指標(biāo)，待測(cè)樣品處理后，把模型放在根據(jù)個(gè)體類型角（Individual Typological Angle，ITA°）繪制的色度卡如圖5，是通過專業(yè)相機(jī)拍照觀察不同處理組模型表面黑素沉積的變化，可以肉眼可見、直觀地呈現(xiàn)待測(cè)物的美白效果如圖6。
待測(cè)物經(jīng)過皮膚模型表面涂抹并滲透到皮膚模型基底層到達(dá)黑色素細(xì)胞發(fā)揮其美白功效，是如何發(fā)揮美白功效、持續(xù)涂抹處理后3D表皮模型中黑色素細(xì)胞是什么狀態(tài)、黑色素合成過程中關(guān)鍵限速酶酪氨酸酶活力怎么樣、黑色素分布情況以及如何可視化呈現(xiàn)等等，這些問題一直是美白產(chǎn)品研發(fā)過程要解決的問題。 
待測(cè)物處理后的黑色素表皮模型進(jìn)行DOPA 染色和甲醛后固定后，顯微鏡水平拍照可以直觀地呈現(xiàn)基底層的黑色素細(xì)胞狀態(tài)以及待測(cè)樣品處理后細(xì)胞差異如圖7,8,9。基于DOPA染色結(jié)果，可以看出黑色素細(xì)胞呈現(xiàn)了正常的胞體形態(tài)表明待測(cè)物沒有明顯的毒性，與基質(zhì)對(duì)照組相比，待測(cè)樣品組黑色素細(xì)胞數(shù)量明顯減少，黑色細(xì)胞形態(tài)多數(shù)呈梭形雙極狀，多極樹突狀細(xì)胞明顯變少變短，限制了向周圍角質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)黑色素的能力。黑色素細(xì)胞胞體顏色明顯比對(duì)照組白，證明酪氨酸酶合成黑色素的活力受到抑制。由此可見，利用3D皮膚模型基于黑色素細(xì)胞DOPA染色不僅可以直觀地評(píng)價(jià)待測(cè)物的美白功效，還能從美白機(jī)制維度給出證據(jù)。
黑色素2D可視化分布采用Fontana-Masson(FM) 嗜銀染色，利用黑色素具有將銀氨溶液還原為金屬銀的特性即嗜銀反應(yīng)來顯示黑色素，染色后黑色素呈黑色如圖10，是目前常用的黑色素特殊染色的方法之一，將染色后的玻片掃描并用ImageJ分析黑色素面積，分析比較對(duì)照組和待測(cè)樣品組差異，確定待測(cè)樣品的美白功效。
另外，我們可以借助不同的顯微鏡技術(shù)掃描3D黑色素表皮模型不同厚度的黑色素，可視化地呈現(xiàn)黑色素的分布和數(shù)量變化如圖11,12（可參考https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34822483/）。
重建3D黑色素表皮模型是一種持續(xù)生長的特殊生物檢測(cè)工具，模型的組織結(jié)構(gòu)、活細(xì)胞層數(shù)、角質(zhì)層厚度隨模型培養(yǎng)生長時(shí)間發(fā)生變化，對(duì)待測(cè)物的吸收滲透能力也隨之發(fā)生改變，所以待測(cè)物表面涂抹的時(shí)間窗口（Time Window）對(duì)檢測(cè)結(jié)果有很大影響。正常機(jī)體條件下黑色素表達(dá)水平不高，可以引入物理或化學(xué)誘導(dǎo)因素比如紫外線UV、α-MSH刺激等，從組成型表達(dá)的黑色素和誘導(dǎo)型表達(dá)的黑色素兩個(gè)維度研究，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的信號(hào)窗口（Signal Window）也有很大影響。格寧生物可以根據(jù)客戶需求定制方法或者參考國內(nèi)團(tuán)標(biāo)的方法開展待測(cè)樣品的美白功效的研究和驗(yàn)證。
總之，重建3D黑色素表皮模型是研究驗(yàn)證待測(cè)樣品美白功效的有效工具之一，可實(shí)現(xiàn)化妝品原料及配方的體外科學(xué)檢測(cè)并與臨床評(píng)估結(jié)果保持一致性，不僅可以回答待測(cè)物是否有美白功效，還可以回答如何發(fā)揮美白功效等調(diào)節(jié)機(jī)制問題，并且具有檢測(cè)周期短，成本低、可重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。重建3D黑色素表皮模型在美白化妝品以及藥物制劑對(duì)調(diào)節(jié)皮膚色素沉著的功效研發(fā)中得到廣泛應(yīng)用。
重建3D黑色素表皮模型以人源正常組織角質(zhì)形成細(xì)胞和黑色素細(xì)胞為種子以一定的比例接種于特定生長環(huán)境中，經(jīng)過浸沒培養(yǎng)和氣液培養(yǎng)增殖分化出類似于正常人表皮復(fù)層組織結(jié)構(gòu)，模擬人使用化妝品場(chǎng)景多次涂抹于模型表面，可以從黑色素細(xì)胞功能、黑色素的合成以及向角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝等多個(gè)功效機(jī)制出發(fā)，通過實(shí)驗(yàn)技術(shù)獲取基因水平、蛋白水平與組織水平等多維度功效數(shù)據(jù)，可以對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行綜合全面的美白功效評(píng)估，比生物化學(xué)法和細(xì)胞生物學(xué)法更系統(tǒng)、更真實(shí)反應(yīng)產(chǎn)品美白功效。
格寧生物（ScreeNingBio，SNB）實(shí)驗(yàn)室于2022年建立了基于體外重建3D黑色素表皮模型Skinovo® -Mela美白功效評(píng)估檢測(cè)平臺(tái)，采用模擬人涂抹化妝品使用場(chǎng)景將一定量待測(cè)物多次均勻涂抹于3D模型表面，主要檢測(cè)指標(biāo)包括黑色素相關(guān)基因表達(dá)、表觀亮度（L值）、模型中黑色素含量，可視化指標(biāo)包括表觀色度、黑色素分布、模型中黑色素細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)和酪氨酸酶活性等如表1。
針對(duì)每一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行詳細(xì)介紹：
國際照明委員會(huì)CIE建立的L*a*b*色度系統(tǒng)，在人體膚色分類、美白化妝品功效評(píng)價(jià)中得到了普遍認(rèn)可和應(yīng)用。其中L*表征表觀亮度，其值越大，顏色越偏向白色，小則越偏向黑色。在美白功效評(píng)估數(shù)據(jù)中，表觀亮度L數(shù)據(jù)可以原始數(shù)據(jù)呈現(xiàn)也可以以ΔL數(shù)據(jù)呈現(xiàn)如圖2。
經(jīng)過待測(cè)物處理后黑色素表皮模型中黑色素含量的變化是衡量待測(cè)物美白功效的黃金標(biāo)準(zhǔn)。黑色素是化學(xué)結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜的一類大分子聚合物，一般采用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿溶解進(jìn)行絕對(duì)定量或相對(duì)定量圖3,4，可以根據(jù)客戶需求選擇方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
格寧生物實(shí)驗(yàn)室重點(diǎn)開發(fā)了基于3D皮膚模型研究美白功效的可視化技術(shù)，表觀色度變化是其中一個(gè)可視化指標(biāo)，待測(cè)樣品處理后，把模型放在根據(jù)個(gè)體類型角（Individual Typological Angle，ITA°）繪制的色度卡如圖5，是通過專業(yè)相機(jī)拍照觀察不同處理組模型表面黑素沉積的變化，可以肉眼可見、直觀地呈現(xiàn)待測(cè)物的美白效果如圖6。
待測(cè)物經(jīng)過皮膚模型表面涂抹并滲透到皮膚模型基底層到達(dá)黑色素細(xì)胞發(fā)揮其美白功效，是如何發(fā)揮美白功效、持續(xù)涂抹處理后3D表皮模型中黑色素細(xì)胞是什么狀態(tài)、黑色素合成過程中關(guān)鍵限速酶酪氨酸酶活力怎么樣、黑色素分布情況以及如何可視化呈現(xiàn)等等，這些問題一直是美白產(chǎn)品研發(fā)過程要解決的問題。
待測(cè)物處理后的黑色素表皮模型進(jìn)行DOPA 染色和甲醛后固定后，顯微鏡水平拍照可以直觀地呈現(xiàn)基底層的黑色素細(xì)胞狀態(tài)以及待測(cè)樣品處理后細(xì)胞差異如圖7,8,9。基于DOPA染色結(jié)果，可以看出黑色素細(xì)胞呈現(xiàn)了正常的胞體形態(tài)表明待測(cè)物沒有明顯的毒性，與基質(zhì)對(duì)照組相比，待測(cè)樣品組黑色素細(xì)胞數(shù)量明顯減少，黑色細(xì)胞形態(tài)多數(shù)呈梭形雙極狀，多極樹突狀細(xì)胞明顯變少變短，限制了向周圍角質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)黑色素的能力。黑色素細(xì)胞胞體顏色明顯比對(duì)照組白，證明酪氨酸酶合成黑色素的活力受到抑制。由此可見，利用3D皮膚模型基于黑色素細(xì)胞DOPA染色不僅可以直觀地評(píng)價(jià)待測(cè)物的美白功效，還能從美白機(jī)制維度給出證據(jù)。
黑色素2D可視化分布采用Fontana-Masson(FM) 嗜銀染色，利用黑色素具有將銀氨溶液還原為金屬銀的特性即嗜銀反應(yīng)來顯示黑色素，染色后黑色素呈黑色如圖10，是目前常用的黑色素特殊染色的方法之一，將染色后的玻片掃描并用ImageJ分析黑色素面積，分析比較對(duì)照組和待測(cè)樣品組差異，確定待測(cè)樣品的美白功效。
另外，我們可以借助不同的顯微鏡技術(shù)掃描3D黑色素表皮模型不同厚度的黑色素，可視化地呈現(xiàn)黑色素的分布和數(shù)量變化如圖11,12（可參考https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34822483/）。
重建3D黑色素表皮模型是一種持續(xù)生長的特殊生物檢測(cè)工具，模型的組織結(jié)構(gòu)、活細(xì)胞層數(shù)、角質(zhì)層厚度隨模型培養(yǎng)生長時(shí)間發(fā)生變化，對(duì)待測(cè)物的吸收滲透能力也隨之發(fā)生改變，所以待測(cè)物表面涂抹的時(shí)間窗口（Time Window）對(duì)檢測(cè)結(jié)果有很大影響。正常機(jī)體條件下黑色素表達(dá)水平不高，可以引入物理或化學(xué)誘導(dǎo)因素比如紫外線UV、α-MSH刺激等，從組成型表達(dá)的黑色素和誘導(dǎo)型表達(dá)的黑色素兩個(gè)維度研究，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的信號(hào)窗口（Signal Window）也有很大影響。格寧生物可以根據(jù)客戶需求定制方法或者參考國內(nèi)團(tuán)標(biāo)的方法開展待測(cè)樣品的美白功效的研究和驗(yàn)證。
總之，重建3D黑色素表皮模型是研究驗(yàn)證待測(cè)樣品美白功效的有效工具之一，可實(shí)現(xiàn)化妝品原料及配方的體外科學(xué)檢測(cè)并與臨床評(píng)估結(jié)果保持一致性，不僅可以回答待測(cè)物是否有美白功效，還可以回答如何發(fā)揮美白功效等調(diào)節(jié)機(jī)制問題，并且具有檢測(cè)周期短，成本低、可重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。重建3D黑色素表皮模型在美白化妝品以及藥物制劑對(duì)調(diào)節(jié)皮膚色素沉著的功效研發(fā)中得到廣泛應(yīng)用。
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