病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)疫苗是指具有類似于天然病毒粒子空間結構的多聚體顆粒的一類疫苗，其含有某種病毒的一個或多個結構蛋白的空心顆粒，沒有病毒核酸，不能自主復制，在形態(tài)上與真正病毒粒子相同或相似。VLPs雖然具有病毒的天然形式和大小，但缺乏遺傳物質，不能自我復制，不具有致病性和傳染性，因此安全性強且免疫原性高，可用于開發(fā)抗病毒疫苗。

VLPs的概念源于1980年代在乙型肝炎(Hepatitis B Virus, HBV)患者血液中發(fā)現的亞病毒顆粒。當施用于健康個體時，這些血漿來源的亞病毒顆粒提供了對HBV的保護，從而產生了第一種基于VLPs的疫苗。 為滿足VLPs疫苗的商品化生產，工藝的可重復性、成本、產能和安全性，表達系統(tǒng)在VLPs疫苗生產過程中就顯得非常重要，不同的表達系統(tǒng)可能影響VLPs的生產效率和質量。目前，已開發(fā)出幾種用于VLPs疫苗生產的表達系統(tǒng)，包括細菌（如大腸桿菌）、酵母、昆蟲細胞、植物、哺乳動物細胞和無細胞表達系統(tǒng)。生產放大中，常用的為大腸桿菌和酵母兩種表達體系。其中，大腸桿菌表達平臺成本低、產量高，適用于簡單VLPs的生產，在修飾方面稍顯不足。酵母表達系統(tǒng)則生長迅速、成本低廉，能提供一定程度的翻譯后修飾，適用于大規(guī)模生產。目前已報導的VLPs疫苗約70％基于真核表達系統(tǒng)，30％基于原核表達系統(tǒng)。
 
對于幾種已經獲批的VLPs疫苗，HBsAg VLPs采用了酵母或CHO細胞；人乳頭瘤病毒(Human Papilloma Virus, HPV) VLPs采用釀酒酵母(Gardasil)或昆蟲細胞(Cervarix)；而戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV) VLPs疫苗Hecolin采用大腸桿菌表達，并體外組裝。此外，無細胞表達系統(tǒng)也已成功應用在VLPs的表達上。

  從結構上來說，VLPs可以分為無包膜VLPs與有包膜VLPs。VLPs疫苗甚至可構建雙層、三層包膜，實現多價疫苗與多聯疫苗的效果。無包膜的VLPs疫苗只包含由病毒的蛋白形成的顆粒，如HPV、HEV等疫苗，結構相對簡單，一般由原核表達系統(tǒng)和低級真核表達系統(tǒng)實現。而有包膜VLPs結構復雜，需要宿主的細胞膜參與構建，比如A型流感病毒和乙型肝炎病毒，一般由真核表達系統(tǒng)實現。   目前，幾種基于VLPs的疫苗已經上市，包括預防乙型肝炎病毒(HBV)的Recombivax HB和Engerix-B，預防人乳頭瘤病毒(HPV)的Gardasil， Cervarix和Gardasil-9，以及應用于預防戊型肝炎病毒(HEV)的Hecolin等。   「HBV乙型肝炎病毒疫苗」
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)是乙型肝炎的主要病原，屬于包膜DNA病毒，包含由脂質和三種包膜蛋白組成的外膜。目前，疫苗接種是預防HBV感染最有效的方法。
 
「HPV人乳頭瘤病毒疫苗」
宮頸癌是全球女性癌癥死亡的第二大常見原因，全世界約70%的宮頸癌由高危HPV亞型16和18導致，四價Gardasil(MSD)是第一個被批準作為人乳頭瘤病毒(HPV)預防性的疫苗。在酵母中表達得到的重組蛋白L1自組裝成VLPs，主要為HPV 6/11/16/18這四種HPV類型引起的病毒感染提供保護。
 
「HEV戊型肝炎病毒疫苗」
HEV是一種非包膜單鏈RNA病毒，其基因組包含3個開放閱讀框，ORF2編碼唯一的結構蛋白。廈門萬泰生物技術有限公司研制的基于截斷的pORF2的HEV239 (Hecolin)于2012年在中國獲批，該疫苗由大腸桿菌表達，是全球首個且唯一的戊肝疫苗。

  「動物VLPs疫苗」
口蹄疫疫苗、小反芻獸疫疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征疫苗、豬圓環(huán)病毒疫苗（Ⅱ型）、豬細小病毒疫苗、高致病性禽流感疫苗、新城疫疫苗、裂谷熱疫苗、藍舌病毒疫苗等。
 
「人用VLPs疫苗」
人用VLPs疫苗，有很多有現役疫苗，是因為基于基因工程重組蛋白構建VLPs，可以完全人工設計、能對VLPs進行多種修飾滿足不同需求，其免疫原性和安全性的可控程度高。例如，手足口疫苗（EV71病毒）、手足口2價疫苗（EV71病毒+CA16病毒）、呼吸道合胞病毒疫苗、諾如病毒疫苗、埃博拉疫苗、流感疫苗、基孔肯雅病毒疫苗、艾滋病疫苗、瘧疾疫苗等。

  純化包括粗純、中間純化及精純等階段。色譜法是VLPs下游工藝的核心操作單元，包括親和層析、離子層析、疏水層析、分子篩層析以及復合模式層析。

   
國內乙肝疫苗有兩種表達方式，分別是CHO細胞、酵母。酵母細胞在制備HBsAg時多為胞內表達，需收獲裂解后澄清，疏水捕獲（HBsAg蛋白的疏水鍵可與疏水配基結合），流穿模式下陰離子去除大量HCP等雜質，分子篩精純去除小分子雜質。而CHO細胞表達系統(tǒng)多為胞外表達，料液中含少量HCP，無需裂解過程。CHO含糖基化HBsAg，更接近天然結構，純化過程與酵母表達系統(tǒng)相比簡單，可在粗純階段選擇疏水作用相對較弱的填料。
 
推薦百林科MaXtar^® 系列HIC，IEX填料，以高剛性瓊脂糖為基架偶聯相對應的疏水基團，反壓低、流速快，適合生物分子的大規(guī)模分離純化。

 
上市HPV疫苗源于大腸桿菌、酵母以及桿狀病毒/昆蟲細胞三種表達系統(tǒng)。
 
百林科MaXtar^® S HC，基架具有更強剛性，在較低反壓下能夠實現更高工藝流速，提高工藝效率。在保證分離效果的同時，兼具高動態(tài)載量。在捕獲階段提供更快速,更高效的分離純化選擇。后續(xù)通過羥基磷灰石(BARONHAP™) 、離子或疏水層析進行精純。
 
多模式層析因為能同時提供不同類型的相互作用力，所以也多用在 VLPs 純化工藝開發(fā)中。百林科MaXtar^® COLL 400和700是新型的多模式層析介質，分子量排阻分別為400KD和700KD，它由兩層不同的結構組成。外殼是多孔的鈍化層，小于對應分子量的雜質進入微球內部與配基基團結合。大于對應分子量的大分子不會進孔，直接走外水流穿；核心是偶聯了同時具有疏水和電荷吸附作用基團的球形內核，最大程度結合宿主蛋白、核酸等雜質。該層析介質能很好的用于多種大分子生物樣本的分離純化，是疫苗生產中病毒純化介質的極佳選擇。

 
案例1—口蹄疫VLPs：  
Ni Chromstar^® Excel 在本次試驗中，樣品加入0.1% 吐溫20和1 mM DTT，且在上樣時添加20 mM 咪唑，洗脫后洗脫液純度較高，且介質載量為4.63 mg/mL。

 
案例2—EV71病毒：
EV71 疫苗，三步層析分別用百林科Chromstar^® 6FF，Q Chromstar^® XL，Puredex^® G-25M 填料進行小試試驗。
本次小試三批 Scale down 完全按照生產批工藝進行。從實驗檢測數據可知，檢測的所有項目均符合其檢測標準，同時與生產批檢測結果相比沒有明顯差異， 達到了平替三步層析填料的效果。 從層析圖譜上可知，小試三批圖譜峰型基本一致，批間穩(wěn)定性較好。與生產批層析圖譜基本一致，跟目前的商業(yè)化規(guī)模圖譜具有可比性。


參考文獻：
[1] Cervera L, Gòdia F, Tarrés-Freixas F, Aguila-Gurrieri C, Carrillo J, Blanco J, Gutiérrez-Granados S. Production of HIV-1-based virus-like particles for vaccination: achievements and limits. Appl Microbiol Biotechnol. 2019 Sep;103(18):7367-7384. 

 

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