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慢病毒下游工藝優(yōu)化策略

瀏覽次數(shù):903 發(fā)布日期:2024-7-26  來源:百林科
慢病毒載體(Lentivirus vector, LV)是逆轉(zhuǎn)錄病毒科的一種包膜病毒,能夠穩(wěn)定整合在分裂和非分裂細胞中表達的轉(zhuǎn)基因,且包裝容量大、細胞毒性和免疫原性低、感染譜廣、可實現(xiàn)穩(wěn)定表達等優(yōu)勢,是當(dāng)前基因治療和細胞療法廣泛使用的病毒載體之一。
 
慢病毒載體是一種有包膜的RNA病毒,直徑為80-120nm,呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)、球形,包裝容量一般為4.5~5kb;慢病毒的活性容易受生產(chǎn)工藝中的壓力,剪切力,溫度,鹽濃度,pH等影響。
 
下面從幾個核心步驟來介紹下慢病毒下游工藝開發(fā)策略:
慢病毒載體下游分離純化工藝基本上采用層析分離技術(shù)和中空纖維膜兩大技術(shù)。一般病毒載體純化層析會用到分子篩,復(fù)合模式和離子交換層析等多種層析方式;中空纖維技術(shù)包括澄清過濾,切向流過濾兩方面。
 
慢病毒純化基本流程及核心工藝步驟優(yōu)化點如下:

 
01 澄清收獲
澄清過濾主要是去除介質(zhì)中的細胞和細胞碎片及部分的HCD,HCP,并降低粘度。常用的方法為深層過濾,離心,死端過濾,或者其中兩種方法結(jié)合為主,但對于50L以上規(guī)模的慢病毒載體的澄清傾向于深層過濾或0.2~0.5μm中空纖維。
 
02 超濾濃縮 1
對澄清過濾溶液使用300~750KDa的中空纖維柱對慢病毒載體溶液濃縮換液,可以去除一部分的蛋白,DNA片段等雜質(zhì)分子。濃縮過程中一般控制剪切力為2000~4000/s-1,TMP為3~7psi,通量>50LMH,濃縮5-10倍。
 
03 核酸酶孵育
加入Benzonase核酸酶,降低DNA分子大小及粘度。核酸酶孵育一般溫度在在25~37℃,處理時間30~60 min;或溫度控制在2~8℃,過夜處理,核酸酶濃度在20-50 U/mL,Mg2+離子濃度在1‑10 mM。
 
04 層析純化
層析純化在慢病毒載體中占有重要地位,一般選擇MaXtar® Q和兩步層析結(jié)合的方式,去除HCP,DNA片段及質(zhì)粒殘留等雜質(zhì);MaXtar® COLL 700(分子篩或多模式層析)層析對小于700KD的HCP,HCD及其他雜質(zhì)成分進入層析介質(zhì)基球的內(nèi)孔,通過離子相互作用疏水左右被保留,而大于700KD的慢病毒不進入內(nèi)孔流穿,從而實現(xiàn)分離;MaXtar® Q以離子相互,與慢病毒載體結(jié)合,保留在MaXtar® Q層析柱上,通過鹽梯度,去除工藝雜質(zhì),收獲高活性的慢病毒載體。
 
由于慢病毒載體受壓力,剪切力,溫度,鹽濃度,pH等因素的影響易聚集,易失活,純化工藝中的一般工藝參數(shù),在15~25℃溫度下層析條件優(yōu)化:MaXtar® COLL 700/400 載量: 3~15CV,流速:150~300cm/h;MaXtar® Q 載量:5~50CV,洗脫鹽濃度:0.5~0.8M NaCl,洗脫液要及時稀釋降低鹽濃度。
 
百林科的MaXtar® COLL 700在慢病毒純化使用中的案例分享:
 
Case1COLL 700 在慢病毒上的應(yīng)用案例
 
 
Case2COLL 700在慢病毒上的應(yīng)用
 

 
結(jié)論:回收率和雜質(zhì)去除效果均達到去除的預(yù)期。
 
 
05 超濾濃縮 2
對澄清過濾溶液使用300~750KDa的中空纖維柱對慢病毒載體溶液濃縮換液。濃縮過程中一般控制剪切力為2000~4000/s-1,TMP為3~7psi,濃縮慢病毒載體至合適的滴度和換液至制劑需要的緩沖液。
 
對于不同慢病毒載體可以選擇以下百林科的產(chǎn)品進行純化分離:  
 
 
以上幾款百林科層析介質(zhì)產(chǎn)品特點可匯總?cè)缦卤恚?/strong>  
 


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來源:百林科醫(yī)藥科技(上海)有限公司
聯(lián)系電話:400-058-9000
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