全能高通量ROTOR+在藻類微生物研究中的應(yīng)用
ROTOR+初是為芽殖酵母(釀酒酵母)遺傳學(xué)而設(shè)計(jì)。對萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)進(jìn)行大規(guī)模的遺傳篩選，ROTOR+的功能可以發(fā)揮很大的作用。然而，衣藻與出芽酵母菌在細(xì)胞大小、生長速度、菌落形態(tài)和粘附性以及光響應(yīng)性方面存在差異。因此，ROTOR+能否適用于衣藻類研究成為了關(guān)鍵。
因此在測試過程中要解決的下面的問題顯得尤為重要：
Q1：細(xì)胞是否通過ROTOR+可靠地從液體或固體介質(zhì)中挑取到RePads復(fù)制針板上，在針頭之間、針板之間、不同平板間，細(xì)胞的數(shù)量/密度是否可以再生?
A1：可重復(fù)性挑取和接種的細(xì)胞數(shù)量，取決于細(xì)胞的表面特性：有多粘稠，粘附(或被排斥)在瓊脂表面的程度等等。衣藻在這些特性上不同于酵母。例如，在使用絲絨(酵母的標(biāo)準(zhǔn)方法)進(jìn)行復(fù)制時，衣藻菌落有很強(qiáng)的傾向，要么完全粘在平板上，要么完全轉(zhuǎn)移到絲絨上。
Q2：細(xì)胞在此過程中是否保持高活力?
A2：轉(zhuǎn)移的細(xì)胞保持高活力顯然是必要的。從我們初的工作中可以清楚地看出，在許多方面，衣藻在某些操作過程中比酵母菌或大腸桿菌更容易受到損傷。例如，當(dāng)從瓊脂上挑取到玻璃或不銹鋼針上時，衣藻在空氣中大約40秒后就會幾乎完全喪失生存能力。
Q3：針頭之間、源板之間或靶板之間是否有明顯的交叉污染?
A3：根據(jù)生物體的特性，可以很容易地想象，活細(xì)胞氣溶膠可以通過ROTOR+復(fù)制操作傳播，導(dǎo)致交叉污染和破壞實(shí)驗(yàn)。
Q4：使用ROTOR+可以可靠接種和區(qū)分的菌落大密度是多少?
A4：菌落可以被接種的大密度取決于生物體的大小和生長速度，并將影響對生物體進(jìn)行篩選的通量。
首先通過ROTOR+對液體到瓊脂的轉(zhuǎn)移展開相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
用Singer PlusPlates方板，注入50ml的TAP瓊脂(標(biāo)準(zhǔn)衣藻培養(yǎng)基)，并添加了50μg/ml氨芐西林來抑制細(xì)菌污染。由于衣藻在液體介質(zhì)中具有很強(qiáng)的流動性，對光線也有很強(qiáng)的敏感性，因此需要將ROTOR+上的內(nèi)部光源取下，并在操作過程中盡可能遮擋光線。如果沒有這種預(yù)防措施，藻類會在源板的不同區(qū)域強(qiáng)烈聚集，會嚴(yán)重影響整個板的菌落再現(xiàn)性。
用一個注入25ml TAP的液體培養(yǎng)基平板，其中含有約10^6cells/ml濕的衣藻(cc-124背景)，用384RePad長針，從液體到瓊脂，從384密度排列成1536密度，(針重復(fù)利用)。在33°C強(qiáng)光照下培養(yǎng)3天(圖1A)，每隔一段時間顯微鏡觀察。
圖1：液體到瓊脂轉(zhuǎn)移
可以看到菌落具有明顯的活力，基本上每個細(xì)胞被接種18小時都形成了一個微菌落(圖1C)。平板的圖像顯示了接種區(qū)域的再生性，不同平板之間也觀察到良好的再生性。
另一方面，在這種固定密度下，菌落之間有明顯的空間分隔，中間沒有污染的菌落產(chǎn)生。
ROTOR+從挑取到接種需要5-10秒。為了測定在空氣中RePad上的衣藻活力，在挑取衣藻后和接種前分別暫停0、10、20和40秒，轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)量及培養(yǎng)后的活力基本保持不變。從含有50ml細(xì)胞懸浮液的SINGER平板中，測試了液體到瓊脂的轉(zhuǎn)移，結(jié)果基本相同，表明了有效液滴大小與針插入的液體深度幾乎無關(guān)。
接下來通過ROTOR+從瓊脂到瓊脂的轉(zhuǎn)移展開實(shí)驗(yàn)。
以含有TAP瓊脂的Singer PlusPlate方板為來源板，上有cc-124背景的衣藻菌膜。使用384RePad長針挑取細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到新板上，連續(xù)點(diǎn)種16個點(diǎn)，過程中不回到來源板，這形成6144個點(diǎn)，每16個點(diǎn)逐漸稀釋接種物。用顯微鏡檢查這些培養(yǎng)皿，并培養(yǎng)成菌落。
從培養(yǎng)的菌落來看，菌落直徑約1毫米，連續(xù)接種導(dǎo)致轉(zhuǎn)移細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，該方法可用于將接種密度降低到孤立的單細(xì)胞。瓊脂-瓊脂接種的細(xì)胞存活率通常很高，幾乎相當(dāng)于液體-瓊脂接種。
一般來說，單個細(xì)胞和由此產(chǎn)生的菌落和微菌落都停留在由針的幾何形狀決定的空間邊界內(nèi)，因?yàn)橐略逶谄桨迳鲜遣换顒拥�，而且�(guī)缀醪恍枰獓婌F或氣溶膠就可以精確地進(jìn)行操作。因此，這些程序適用于在有限的空間和耗材里，大限度培養(yǎng)和轉(zhuǎn)移衣藻。
因此在測試過程中要解決的下面的問題顯得尤為重要：
Q1：細(xì)胞是否通過ROTOR+可靠地從液體或固體介質(zhì)中挑取到RePads復(fù)制針板上，在針頭之間、針板之間、不同平板間，細(xì)胞的數(shù)量/密度是否可以再生?
A1：可重復(fù)性挑取和接種的細(xì)胞數(shù)量，取決于細(xì)胞的表面特性：有多粘稠，粘附(或被排斥)在瓊脂表面的程度等等。衣藻在這些特性上不同于酵母。例如，在使用絲絨(酵母的標(biāo)準(zhǔn)方法)進(jìn)行復(fù)制時，衣藻菌落有很強(qiáng)的傾向，要么完全粘在平板上，要么完全轉(zhuǎn)移到絲絨上。
Q2：細(xì)胞在此過程中是否保持高活力?
A2：轉(zhuǎn)移的細(xì)胞保持高活力顯然是必要的。從我們初的工作中可以清楚地看出，在許多方面，衣藻在某些操作過程中比酵母菌或大腸桿菌更容易受到損傷。例如，當(dāng)從瓊脂上挑取到玻璃或不銹鋼針上時，衣藻在空氣中大約40秒后就會幾乎完全喪失生存能力。
Q3：針頭之間、源板之間或靶板之間是否有明顯的交叉污染?
A3：根據(jù)生物體的特性，可以很容易地想象，活細(xì)胞氣溶膠可以通過ROTOR+復(fù)制操作傳播，導(dǎo)致交叉污染和破壞實(shí)驗(yàn)。
Q4：使用ROTOR+可以可靠接種和區(qū)分的菌落大密度是多少?
A4：菌落可以被接種的大密度取決于生物體的大小和生長速度，并將影響對生物體進(jìn)行篩選的通量。
首先通過ROTOR+對液體到瓊脂的轉(zhuǎn)移展開相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
用Singer PlusPlates方板，注入50ml的TAP瓊脂(標(biāo)準(zhǔn)衣藻培養(yǎng)基)，并添加了50μg/ml氨芐西林來抑制細(xì)菌污染。由于衣藻在液體介質(zhì)中具有很強(qiáng)的流動性，對光線也有很強(qiáng)的敏感性，因此需要將ROTOR+上的內(nèi)部光源取下，并在操作過程中盡可能遮擋光線。如果沒有這種預(yù)防措施，藻類會在源板的不同區(qū)域強(qiáng)烈聚集，會嚴(yán)重影響整個板的菌落再現(xiàn)性。
用一個注入25ml TAP的液體培養(yǎng)基平板，其中含有約10^6cells/ml濕的衣藻(cc-124背景)，用384RePad長針，從液體到瓊脂，從384密度排列成1536密度，(針重復(fù)利用)。在33°C強(qiáng)光照下培養(yǎng)3天(圖1A)，每隔一段時間顯微鏡觀察。
圖1：液體到瓊脂轉(zhuǎn)移
可以看到菌落具有明顯的活力，基本上每個細(xì)胞被接種18小時都形成了一個微菌落(圖1C)。平板的圖像顯示了接種區(qū)域的再生性，不同平板之間也觀察到良好的再生性。
另一方面，在這種固定密度下，菌落之間有明顯的空間分隔，中間沒有污染的菌落產(chǎn)生。
ROTOR+從挑取到接種需要5-10秒。為了測定在空氣中RePad上的衣藻活力，在挑取衣藻后和接種前分別暫停0、10、20和40秒，轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)量及培養(yǎng)后的活力基本保持不變。從含有50ml細(xì)胞懸浮液的SINGER平板中，測試了液體到瓊脂的轉(zhuǎn)移，結(jié)果基本相同，表明了有效液滴大小與針插入的液體深度幾乎無關(guān)。
接下來通過ROTOR+從瓊脂到瓊脂的轉(zhuǎn)移展開實(shí)驗(yàn)。
以含有TAP瓊脂的Singer PlusPlate方板為來源板，上有cc-124背景的衣藻菌膜。使用384RePad長針挑取細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到新板上，連續(xù)點(diǎn)種16個點(diǎn)，過程中不回到來源板，這形成6144個點(diǎn)，每16個點(diǎn)逐漸稀釋接種物。用顯微鏡檢查這些培養(yǎng)皿，并培養(yǎng)成菌落。
從培養(yǎng)的菌落來看，菌落直徑約1毫米，連續(xù)接種導(dǎo)致轉(zhuǎn)移細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，該方法可用于將接種密度降低到孤立的單細(xì)胞。瓊脂-瓊脂接種的細(xì)胞存活率通常很高，幾乎相當(dāng)于液體-瓊脂接種。
一般來說，單個細(xì)胞和由此產(chǎn)生的菌落和微菌落都停留在由針的幾何形狀決定的空間邊界內(nèi)，因?yàn)橐略逶谄桨迳鲜遣换顒拥�，而且�(guī)缀醪恍枰獓婌F或氣溶膠就可以精確地進(jìn)行操作。因此，這些程序適用于在有限的空間和耗材里，大限度培養(yǎng)和轉(zhuǎn)移衣藻。
標(biāo)簽：
挑菌/接種/復(fù)制
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