ELISA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)有關(guān)特異性問題淺析
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）是一種使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定的免疫測(cè)定法，用于檢測(cè)和定量生物分子，其它免疫診斷方法一樣酶免試劑在它的研究、生產(chǎn)及使用中常常會(huì)碰到非特異性問題。
1、試劑盒特異性因素
1、1 固相載體的選擇。
ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種，以微量滴定板最為常見。它具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值低，各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯y(tǒng)i 烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此，在選擇試劑盒同時(shí)要對(duì)其使用的微孔板型號(hào)進(jìn)行認(rèn)證，評(píng)估。
1、2包被物的純度。
在酶聯(lián)免疫測(cè)定尤其是間接ELISA中，試劑的特異性取決于使用抗原的純度。目前由于技術(shù)條件的限制，包被用抗原或抗體的純度不可能達(dá)到100%，所以有些非特異性顯色不可避免，只能盡可能提高純度，提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原。
1、3包被抗體的效價(jià)。
具有高親和力和高特異性的包被抗體，是決定試劑特異性的重要方面。
1、4 封閉。
是ELISA中重要的一步，目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙，減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾。
2、檢驗(yàn)標(biāo)本中含有酶標(biāo)記物的干擾物
2、1內(nèi)源性干擾物：
類風(fēng)濕因子(RF)、黃疸等，類風(fēng)濕因子是可作用于多種動(dòng)物以及人IgGFc段的自身抗體，多數(shù)為IgM類，能充當(dāng)抗原成分與固相及酶標(biāo)抗體反應(yīng)，從而呈現(xiàn)非特異性顯色。
黃疸血標(biāo)本中常含有內(nèi)源性過氧化物酶，如用辣根過氧化物酶為標(biāo)記物，就有可能產(chǎn)生非特異性顯色。
2、2 外源性干擾物，
常常因樣品采集、貯存、處理不當(dāng)造成如樣品溶血，被細(xì)菌污染，標(biāo)本凝集不全等。溶血標(biāo)本，紅細(xì)胞溶解破裂，釋放出血紅素形成，而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP(辣根過氧化酶)[2]，有國(guó)內(nèi)報(bào)道酶免HAg試劑檢測(cè)溶血標(biāo)本時(shí)可造成假陽(yáng)性。如在冰箱中保存過久，其中的IgG可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。因此，血標(biāo)本在采集處理時(shí)應(yīng)小心，在冰箱中保存不易過久。
標(biāo)本凝集不全時(shí)，血清中會(huì)殘留部分纖維蛋白原，也易造成假陽(yáng)性。
3、操作過程中的問題造成假陽(yáng)性
3、1加樣
對(duì)于間接ELISA標(biāo)本一般都要進(jìn)行稀釋，如果加樣不準(zhǔn)就會(huì)造成誤差，尤其當(dāng)稀釋倍數(shù)大時(shí)，很小的絕對(duì)誤差，會(huì)導(dǎo)致較大的相對(duì)誤差，使陰性(或弱陽(yáng)性)標(biāo)本呈陽(yáng)性(或陰性)。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。目前，大部分血站都已使用全自動(dòng)酶免加樣系統(tǒng)處理標(biāo)本，可較好地避免以上誤差。
3、2洗滌
在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)健一步，應(yīng)引起操作者重視。無(wú)論是手工操作還是機(jī)器操作，得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān)，ELISA就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。
3、3 溫育
每種試劑都有其最佳反應(yīng)模式，其中溫度和溫育時(shí)間控制是重要因素。因孵育溫度高，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)造成整板本底高，陽(yáng)性率高。溫育一般用濕盒或水浴，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板溫度都能迅速平衡，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋。
3、4酶標(biāo)儀判讀
作為記錄測(cè)定結(jié)果的儀器，酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否，決定結(jié)果的可靠度。首先酶標(biāo)儀應(yīng)定期進(jìn)行保養(yǎng)，對(duì)濾光片要定期校正；其次酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置要正確，最好使用雙波長(zhǎng)，一個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)，一個(gè)參比波長(zhǎng)，以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外，在用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)最好先擦試微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標(biāo)儀性能有所不同。
1、試劑盒特異性因素
1、1 固相載體的選擇。
ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種，以微量滴定板最為常見。它具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值低，各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯y(tǒng)i 烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此，在選擇試劑盒同時(shí)要對(duì)其使用的微孔板型號(hào)進(jìn)行認(rèn)證，評(píng)估。
1、2包被物的純度。
在酶聯(lián)免疫測(cè)定尤其是間接ELISA中，試劑的特異性取決于使用抗原的純度。目前由于技術(shù)條件的限制，包被用抗原或抗體的純度不可能達(dá)到100%，所以有些非特異性顯色不可避免，只能盡可能提高純度，提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原。
1、3包被抗體的效價(jià)。
具有高親和力和高特異性的包被抗體，是決定試劑特異性的重要方面。
1、4 封閉。
是ELISA中重要的一步，目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙，減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾。
2、檢驗(yàn)標(biāo)本中含有酶標(biāo)記物的干擾物
2、1內(nèi)源性干擾物：
類風(fēng)濕因子(RF)、黃疸等，類風(fēng)濕因子是可作用于多種動(dòng)物以及人IgGFc段的自身抗體，多數(shù)為IgM類，能充當(dāng)抗原成分與固相及酶標(biāo)抗體反應(yīng)，從而呈現(xiàn)非特異性顯色。
黃疸血標(biāo)本中常含有內(nèi)源性過氧化物酶，如用辣根過氧化物酶為標(biāo)記物，就有可能產(chǎn)生非特異性顯色。
2、2 外源性干擾物，
常常因樣品采集、貯存、處理不當(dāng)造成如樣品溶血，被細(xì)菌污染，標(biāo)本凝集不全等。溶血標(biāo)本，紅細(xì)胞溶解破裂，釋放出血紅素形成，而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP(辣根過氧化酶)[2]，有國(guó)內(nèi)報(bào)道酶免HAg試劑檢測(cè)溶血標(biāo)本時(shí)可造成假陽(yáng)性。如在冰箱中保存過久，其中的IgG可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。因此，血標(biāo)本在采集處理時(shí)應(yīng)小心，在冰箱中保存不易過久。
標(biāo)本凝集不全時(shí)，血清中會(huì)殘留部分纖維蛋白原，也易造成假陽(yáng)性。
3、操作過程中的問題造成假陽(yáng)性
3、1加樣
對(duì)于間接ELISA標(biāo)本一般都要進(jìn)行稀釋，如果加樣不準(zhǔn)就會(huì)造成誤差，尤其當(dāng)稀釋倍數(shù)大時(shí)，很小的絕對(duì)誤差，會(huì)導(dǎo)致較大的相對(duì)誤差，使陰性(或弱陽(yáng)性)標(biāo)本呈陽(yáng)性(或陰性)。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。目前，大部分血站都已使用全自動(dòng)酶免加樣系統(tǒng)處理標(biāo)本，可較好地避免以上誤差。
3、2洗滌
在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)健一步，應(yīng)引起操作者重視。無(wú)論是手工操作還是機(jī)器操作，得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān)，ELISA就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。
3、3 溫育
每種試劑都有其最佳反應(yīng)模式，其中溫度和溫育時(shí)間控制是重要因素。因孵育溫度高，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)造成整板本底高，陽(yáng)性率高。溫育一般用濕盒或水浴，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板溫度都能迅速平衡，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋。
3、4酶標(biāo)儀判讀
作為記錄測(cè)定結(jié)果的儀器，酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否，決定結(jié)果的可靠度。首先酶標(biāo)儀應(yīng)定期進(jìn)行保養(yǎng)，對(duì)濾光片要定期校正；其次酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置要正確，最好使用雙波長(zhǎng)，一個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)，一個(gè)參比波長(zhǎng)，以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外，在用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)最好先擦試微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標(biāo)儀性能有所不同。
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